环介导等温扩增法快速检测乳中阪崎肠杆菌

董鑫悦，满朝新，卢 雁，郭 颖，王今雨，杨相宜，郎 友，庞心怡，姜毓君，，*

(1.东北农业大学国家乳业工程技术研究中心，黑龙江哈尔滨150086; 2.东北农业大学食品学院，乳品科学教育部重点实验室，黑龙江哈尔滨150030)

阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)是一种革兰氏阴性、无芽孢的兼性厌氧细菌［1］。它能导致任何年龄层人群的疾病，尤其是对早产儿、出生体重轻的婴儿或免疫受损婴儿的威胁最大，能引起新生儿败血症、脑膜炎和坏死性小肠结肠炎［2］。然而，传统的检测方法操作复杂、耗时长以及需要复杂昂贵的仪器［3］。因此，建立一种快速简便的检测阪崎肠杆菌的方法一直是众多学者研究的热点。环介导等温扩增技术(loop－mediated isothermal amplification，LAMP)由Notom i等于2000年建立，该技术针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用具有链置换活性的Bst DNA聚合酶，在恒温条件下(60～65℃)高效(0.5～1.0h)扩增目标DNA，具有很高的特异性和灵敏度，快速简便，扩增产物量大，肉眼、电泳、浊度仪或肉眼均可进行检测［4－5］。本研究拟利用环介导等温扩增技术检测乳中的阪崎肠杆菌，建立一种快速检测乳中阪崎肠杆菌的方法，为这一方法的推广应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

阪崎肠杆菌(ATCC29544、ATCC51329)、金黄色葡萄球菌(ATCC13565、CMCC26074、CMCC26075、CMCC26112)、鼠伤寒沙门氏菌(CMCC50222)、亚利桑那沙门氏菌(CMCC47020)、都柏林沙门氏菌(CMCC50042)、汤卜逊沙门氏菌(CMCC50120)、单增李斯特菌(CMCC54004、CMCC54006、CMCC54002)

中国食品药品检定研究院;大肠杆菌(ATCC25922)、大肠杆菌 O1、英诺克李斯特菌(ATCC33090)、铜绿假单胞杆菌(ATCC27853)、蜡样芽孢杆菌 (CMCC63303)、福氏志贺氏菌(CMCC51572) 福建省疾病预防控制中心;阪崎肠杆菌(BQ－1、BQ－2)、大肠杆菌O157:H7、藤黄微球菌(ATCC4698) 实验室保存Bst大片段DNA聚合酶 New England Biolab;细菌基因组DNA提取试剂盒 北京百泰克生物技术有限公司;甜菜碱(Betaine) 美国Sigma公司;DNA提取液(0.1mol/L Tris－Hcl、0.1mol/L EDTA、0.1mol/L Na3PO4、1.5mol/L NaCl、1%CTAB，溶解后调节pH8.0，室温保存);9700型PCR仪 美国ABI公司;UVP凝胶成像系统 美国UVP公司;引物序列由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。

1.2 实验方法

1.2.1 细菌培养以及DNA模板的制备 阪崎肠杆菌ATCC29544及23株其他菌株培养于营养肉汤培养基中，37℃培养到对数生长期。按照细菌基因组DNA抽提试剂盒说明书提取细菌基因组DNA，溶于无菌水中，－20℃保存备用。

1.2.2 引物设计及合成 选取Genbank中阪崎肠杆菌 OmpA 基 因 序 列［6］(Accession number: DQ000206)，利用LAMP引物在线设计软件设计一套特异性引物，包括B3，F3，FIP，BIP，LF，LB。引物序列:B3－GATTCGCCCATACCACGAT;

1.2.3 LAMP反应的体系优化与确立

1.2.3.1 LAMP反应体系的优化 参考文献［7－9］，选择不同浓度比例的外引物和内引物(1∶4～1∶9)、不同浓度比例的外引物和环引物(1∶1～1∶5)、不同浓度梯度的MgCl2(0～6mmol/L)、不同浓度梯度的dNTPs (0.4～2.4mmol/L)、不同添加量的Bst DNA聚合酶(0.5～1.0μL)进行LAMP反应，电泳观察扩增结果，根据是否形成典型的梯状条带以及条带的亮暗来确定最佳反应条件。

1.2.3.2 LAMP反应体系 配制25μL反应体系，分别将一定量的内引物、外引物、环引物、MgCl2、脱氧核糖核苷酸(dNTPs)、甜菜碱、Bst DNA聚合酶大片段、10×Buffer、DNA模板混匀，用灭菌水补齐。反应条件:95℃5m in，迅速冷却加入酶，64℃保持40m in，80℃保持2min反应结束。

1.2.4 LAMP检测阪崎肠杆菌的灵敏度和特异性 将计好数的阪崎肠杆菌液进行十倍梯度稀释，取各稀释度菌液1m L，提取其DNA，取2μL作为模板进行PCR和LAMP反应。

用建立的LAMP方法分别对上述所列4株阪崎肠杆菌和19株非阪崎肠杆菌进行扩增，电泳观察结果，验证LAMP方法特异性。

1.2.5 LAMP检测人工污染乳中阪崎肠杆菌

1.2.5.1 人工污染乳中阪崎肠杆菌基因组DNA的提取方法比较 试剂盒法(细菌基因组DNA提取试剂盒)按照说明书的步骤进行DNA提取;热裂解法:人工污染的灭菌乳中分别加入1m L无水乙醇、1m L氯仿、1m L氨水混匀。12000 r/m in离心10min弃上清。加入200μL灭菌水混匀后，10000 r/m in离心1m in，弃上清。加入100μL灭菌水混匀，于沸水浴中煮沸10m in，10000r/min离心1m in，取上清－20℃备用;蛋白酶K法:1m L样品中分别加入1m L DNA提取液、10μL溶菌酶、10μL蛋白酶K混匀后，37℃ 200 r/m in振荡孵育1.5h。加入50μL的20%SDS，65℃孵育20m in。然后，12000r/min离心1min，取上清。在得到的上清液中加入1m L的异丙醇，混匀后加入吸附柱AC中10000 r/min离心30s，去上清。所得的沉淀用预冷的70%乙醇重复洗涤和干燥三次。最后加入50μL的TE缓冲液溶解DNA，－20℃保存备用。

1.2.5.2 人工污染乳的检出限 从当地超市购买的液体乳经过灭菌后，人为添加不同稀释度的阪崎肠杆菌于乳中。分别提取各个稀释度人工污染乳中阪崎肠杆菌的DNA，取2μL作为模板进行LAMP反应。

2 结果与讨论

2.1 LAMP检测方法的建立

对阪崎肠杆菌ATCC29544的DNA模板进行扩增，肉眼可见浑浊，琼脂糖凝胶电泳后出现典型的梯形条带。

图1 阪崎肠杆菌标准菌株LAMP检测结果Fig.1 LAMP detection of Enterobacter sakazakii

2.2 LAMP反应体系的优化

通过上述优化方法，最终确定LAMP的反应体系为:0.2μmol/L外引物，1.6μmol/L内引物，0.6μmol/L环引物，2mmol/L MgCl2，2mmol/L dNTPs，1μL的Bst DNA聚合酶(8U)，10×Buffer及2μL模板。在此反应体系下，得到最佳的扩增效果，保证了结果的稳定性和特异性。

2.3 LAMP检测纯培养物的灵敏度

经平板计数，原始菌液浓度为3.7×109cfu/m L。从图2可见，泳道2～10都有LAMP扩增条带，而11、 12未见LAMP扩增。由此可见，本研究建立的LAMP方法对阪崎肠杆菌纯培养物的检出限为 3.7×101cfu/m L。

图2 LAMP检测阪崎肠杆菌纯培养物的灵敏度电泳图Fig.2 The sensitivity of LAMP reaction for Enterobacter sakazakii

由图3可见，泳道2～9都有PCR扩增条带，而10、11未见PCR扩增条带。由此可见，PCR检测阪崎肠杆菌的灵敏度为3.7×102cfu/m L。本实验建立的LAMP方法灵敏度是PCR方法的10倍。

图3 PCR检测阪崎肠杆菌纯培养物的灵敏度电泳图Fig.3 The sensitivity of PCR reaction for Enterobacter sakazakii

2.4 LAMP特异性实验

结果表明，两株阪崎肠杆菌标准株以及两株阪崎肠杆菌野株均呈阳性反应。其他19株非阪崎肠杆菌均呈阴性反应，未出现梯形条带。

2.5 人工污染乳中阪崎肠杆菌DNA的提取

分别采用试剂盒法、热裂解法以及手提DNA法提取人工污染乳中的阪崎肠杆菌DNA，LAMP扩增结果都有典型的梯形条带，且差异不大。热裂解法操作简单，而且能节省很多时间，所以选取了热裂解法提取乳中DNA。

2.6 人工污染乳中LAMP的检测限

人工污染乳的阪崎肠杆菌的浓度从4.3×108～4.3×10－1cfu/m L，分别提取DNA进行LAMP反应，结果如图6所示。泳道2～9均有LAMP扩增条带，而10、11泳道未见扩增条带。由此可见，LAMP检测人工污染乳中阪崎肠杆菌的检测限为4.3×101cfu/m L。

图4 LAMP特异性实验电泳图Fig.4 The specificity of LAMP reaction

图5 三种不同方法提取乳中DNA的LAMP实验结果Fig.5 Three differentmethods of DNA extraction

图6 LAMP检测人工污染乳中阪崎肠杆的灵敏度电泳图Fig.6 The sensitivity of LAMP reaction for Enterobacter sakazakii inmilk

3 结论

3.1 目前，阪崎肠杆菌的分子生物学检测方法主要是PCR方法和荧光定量PCR法［10］。而LAMP方法应用到液体乳中的研究相对较少，本研究进行了LAMP检测液体乳中阪崎肠杆菌的初步探索。本实验建立的检测乳中阪崎肠杆菌的LAMP方法，操作简便，不需要复杂的仪器，反应过程只需水浴锅即可［11］;LAMP引物的设计是针对6个区域设计的，特异性强［12］，根据特异性实验同样证明的这一点;灵敏度高［13］，本实验建立的方法灵敏度比普通的PCR方法灵敏度高10倍左右;由于添加了环引物，使得LAMP反应时间大大减少。并且对于样品处理方法进行了选择优化，缩短了模板制备的时间，使得整个实验过程能在2h内完成。

3.2 在LAMP方法中，设计出灵敏度高、特异性强的LAMP引物是实验成功的关键点之一。在设计引物的时候，注意Tm值的设置、GC含量、引物末端稳定性、二级结构等问题［14］。本研究所建立的LAMP检测乳中阪崎肠杆菌方法有很多地方需要进一步探索和完善［15］，例如结果鉴定的手段较为单一，主要依靠琼脂糖凝胶电泳，不能满足现场检测的需求。而现有结果鉴定方法中，荧光染料法方便快捷，灵敏度较高。浊度检测法则通过是否产生白色沉淀来判定是否进行LAMP反应［16］。所以，在以后的研究中可以对结果判定方面进行不同的探索。

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