生肌决定因子Myf6基因多态性与畜禽生产性状的关系

富国文，陈江明，王绍卿，程志斌，四朗玉珍，吴玉江，荣 华，贾俊静，樊月圆*

(1.云南农业大学 动物科学技术学院，云南 昆明 650201；2.西藏自治区农科院 畜牧兽医研究所，西藏 拉萨 850009)

生肌决定因子(MyoD)又称生肌调节因子(myogenic regulatorv factors，MRFs)， 是一个控制肌肉细胞增殖和分化的基因家族，同肌肉纤维的数量、粗细有非常密切的联系，对肉质和特有风味有极其重要的影响[1]。目前已在哺乳动物发现4个家族成员，它们分别编码Myf3、MyoG、Myf5和Myf6共4种功能互异的转录因子，而Myf6基因在不同哺乳动物中又可称为MRF4或herculin[2-5]。Myf3、MyoG、Myf5和Myf6通过独自或协同的作用方式成为调控和生成骨骼肌方面的关键控制因子。对于MyoD、MyoG以及Myf5等生肌决定因子基因家族基因的研究已经有许多较详细的报道，研究较为深入，但目前对畜禽品种或品系Myf6基因的遗传及变异特征及其与畜禽品系肉质和风味之间的关联研究鲜有报道。

本文从Myf6基因的结构、变异特征以及不同基因型与生产性状的相关性几个方面的最新进展情况和研究成果进行综述，并以此为基础深入探讨Myf6基因的遗传效应，目的在于寻找与畜禽产肉性能、胴体品质与风味等性状相关的遗传标记，为高产高质肉用畜禽的分子育种提供理论依据。

1 Myf6基因的结构特征

MyoD基因家族于1987年由Davis克隆并首次发现[6]，其后在1989年由Braun等凭借人与小鼠间MyoD的同源性从人类胎盘的骨骼肌cDNA文库中分离并获得MyoD基因家族成员基因，并且在1989年至1990年间，将Myf3、MyoG定位于人类第1l号染色体上，将Myf5、Myf6定位于人类第l2号染色体上。在GenBank上可查阅到家鼠(Musmusculus)、家鸡(Gallusgallus)、家猪(Susscrofa)、牛(Bostaurus)、水牛(Bubalusbubalis)、人(Homosapiens)等物种Myf6基因的序列信息。

Myf6基因是MyoD家族的成员，在其基因家族中都有一个由70个氨基酸残基组成的同源性达80%的同源片段，是一类具有螺旋-环-螺旋(basic helix-loop-helix，bHLH)碱性区核蛋白的骨骼肌特异性转录调节因子[7]。但是，BHLH高度保守， Basic结构是HLH 螺旋结构的延伸而与该家族蛋白与DNA相互作用的部位，而HLH螺旋结构是调控与其他因子相互作用的重要区域。在BHLH区域外，还有一个是紧靠碱性区的富含丝氨酸和苏氨酸的生肌识别基序 (myogenic recognition motif，MRM)的G末端，这是导致MyoD家族各成员功能差异的分子基础。同时BHLH自身在MyoD分子结构中形成的α-螺旋二聚体和四聚体中，唯有二聚体才能与DNA结合，并且二聚体要满足其4个螺旋必须以平行方向排列、2个碱性区紧靠、每个区域要同时存在而不单独存在的条件，才能使其与DNA结合有效地激发生肌作用。因此，需与E蛋白家族中E47、E12等形成异二聚体并结合于目标基因上游启动子和增强子，以反式激活致使骨骼肌特异基因的表达，例如肌球蛋白、肌肉肌酸激酶(Muscle creatine kinase，MCK)、乙酰胆碱受体(AchR)等[8-9]，从而激发生肌作用[10]。

2 Myf6基因的功能及时空表达

2.1 Myf6基因在肌肉分化中的作用

研究证明，小鼠在去除MyoD和Myf5基因后没有肌肉形成，没有肌肉生成标志出现，也没有MyoG促进的转录过程[11]。小鼠去除MyoD而保留Myf5基因，只有半量的Myf5和MyoGmRNA表达。小鼠被去除MyoG基因，在胚胎鼠肌细胞正常生成部位可产生接近正常水平但不能形成肌肉细胞的成肌细胞。这表明MyoG处于MyoD或Myf5基因的下游，在成肌细胞向肌小管转变的过程中发挥特异性的作用，而肌纤维的生成和肌肉表型的维持则依赖于Myf6基因。Olson等[12]在基因敲除(gene knock out)试验中表明，Myf6不同等位点敲除可引起小鼠发育呈现从成活到完全致死不同的表型，这种小鼠发育表型异常可能与Myf6变异影响Myf5基因功能表达有关。综上所述，MyoD与Myf5基因具有同源性调控成肌过程，而MyoG与Myf6具有同源性，在肌肉细胞分化过程中起重要作用[13]。

小鼠在敲除MyoG基因后，其胚胎通过表达MyoG启动子驱动Myf6，从而在一定程度上促进和弥补肌肉的产生[14]。而在胚胎干细胞敲除MyoG基因后，Myf6基因的过量表达才是致使肌纤维完全分化的根本原因[15]， 而不是MyoD[16]。Myf6基因在转染成纤维细胞后，其细胞中Myf6 蛋白和mRNA表达量都极显著升高。肌肉肌酸激酶基因、肌球蛋白轻链基因等成纤细胞中肌肉特异性基因的mRNA总体升高，这表明成纤维细胞在转染后有向肌肉细胞分化的趋向，但细胞形态没有明显改变，这也表明Myf6基因促使细胞向肌细胞分化的能力较弱[17]，与Myf6 基因促使其他细胞向肌肉细胞分化具有特异性的结论相符合[18]。综上所述，Myf6基因在肌肉细胞的表达中起着独特的作用，不过其机制还有待研究。同时也表明MyoG与Myf6之间同源性较大，而MyoD与Myf5之间同源性相对较小，并且MyoG与Myf6基因均在肌肉细胞分化过程中发挥作用，诱导成肌细胞分化并融合成肌管[19]。

2.2 Myf6基因表达的时空模式

在动物生长发育过程中，MyoD基因家族以其特定的表达模式控制骨骼肌的增殖和分化，既有时间、位置和表型的区别，又有种属的差异。在鸡胚胎期，Myf6基因 mRNA在第9 d就有少量表达,9 d以后表达量迅速上升，到13 d时达到高峰后下降,15 d以后的表达量基本恒定[20]。而在小鼠胚胎发育过程中，Myf5、MyoG、Myf6和MyoD分别于胚胎形成第8 d、8.5 d、9 d、10.5 d表达。在这期间另一转录因子MEF2(myoeyi-enhancer binding factor2)于胚胎形成第8.5 d表达，表明Myf6与MEF2 在调节肌肉特异基因表达过程中有协同作用和重叠效应[21]。MyoD家族成员至少有部分功能相同，但每一MyoD成员又都各自有其独特的功能。MyoD基因家族各成员在动物肌发生中的功能差异源于其成员的表达模式存在迥异[22-24]。胚胎Myf6基因的表达只存在中胚层肌肉生成区以及一些生肌前体细胞中[25]。Myf6在小鼠胚胎第9 d呈一过性表达，之后表达量随着时间的推移而减少，在第11.5 d时停止，其后又在第16 d肌肉分化再次表达，此时肌管大量分化，肌纤维逐渐形成，且在小鼠出生后一直维持较高水平，这可能对建立和维持肌肉分化功能有关[26-27]。Myf6与其它MyoD基因家族成员不同，可能存在着为维持肌肉持续分化状态而在成年哺乳动物肌肉中持续表达[28]。

3 Myf6与畜禽生产性状的关联研究

Myf6基因是脊椎动物胚胎发育过程中骨骼肌发生的主导调节基因之一，其编码产物可诱导成肌细胞分化融合成肌管[29]、促进肌纤维的形成并且维持肌肉的表型[30]。Hande等[31]研究表明，Myf6基因的变异会影响肌纤维的数量和组织学特性，以致Myf6 基因对胴体性状和肉质性状等与肌肉的组织学特性密切相关的性状间都存在较大的遗传影响作用。但是，动物肌肉组织中的肌纤维数量在胚胎期就已经确定，正常情况下肌肉组织中的肌纤维在动物出生后就不会再发生数量上的变化，其生长是通过肌卫星细胞的增殖和分化而致使肌纤维长度和粗度增加来实现，并不源于肌细胞数目的变化[32]。

3.1 Myf6基因变异与禽生产性状间的关联性

孙文浩等[1]以 5个优良肉鸡纯系和3个杂交配套系肉鸡为研究对象，通过测序和单链构象多态(SSCP)的方法分析了Myf6基因的群体遗传信息，如遗传分布和变异及其群体杂合性，并研究了Myf6基因对胴体和肉质性状的遗传影响。研究结果表明，Myf6基因的CDS区高度保守，仅在外显子l的47位处发生了G-A点突变；Myf6基因部分基因型尤其是野生AA型基因对提高活体重、屠体重、胸腿肌重等性状有显著影响，同时Myf6的A基因具有使肌纤维生长更充分和变粗的作用，且主要以加性作用方式发挥作用。

3.2 Myf6基因变异与猪生产性状间的关联性

Vykoukalova等[33]利用两点连锁分析和放射性杂交技术将Myf6基因定位在猪第5号染色体上，并参考人与小鼠Myf6基因序列设计引物扩增出一段长379 bp的包括部分外显子1和外显子2及其间的内含子1的序列。分析结果显示：在该序列内含子1中存在3个SNP突变位点；朱砺等[34]以12个中外猪种及部分杂交群体为材料，对Myf6基因进行研究分析发现，其内含子1中的Ava Ⅰ的位点多态性不丰富，A等位基因在大部分中国猪种中已彻底稳固，B等位基因仅以较低的频率存在于外国猪种及具有外国猪血缘的杂交群体中。AB基因型以50.34%平均瘦肉率极显著高于AA基因型45.88%平均瘦肉率，AB基因型以27.10 cm2眼肌面积极显著高于AA基因型22.57 cm2眼肌面积，同时AB基因型以39.89%的皮脂率极显著小于AA基因型44.50%皮脂率。这也表明B等位基因在提高瘦肉率和腿肌面积而提升胴体品质方面遗传效益明显；任斌[35]对10个品种猪通过PCR-RFLP方法分析Myf6基因遗传多态性研究表明，CC基因型以一定的正效应作用方式具有增加胴体瘦肉和降低背腰厚度的作用，而AA基因型都具有降低失水率和贮存损失率的作用。

3.3 Myf6基因变异与反刍动物生产性状的关联性

Ryan等[36]通过小鼠、人和牛的cDNA探针将牛的Myf6基因定位于牛第5号染色体上；Hansen等[37]通过荧光原位混合法、遗传连锁分析以及放射性杂交绘图技术将与牛胴体性状相关的Myf5、Myf6、EIF1、WNT10B/MMP19等基因进行了定位，其中将Myf5和Myf6定位于5q13；Bhuiyan等[38]通过对7个牛品种的MyoD基因家族的研究，在Myf6基因外显子1及3'-UTR共发现了3个SNP突变位点，研究表明Myod1基因1274A>G突变显著影响韩牛的活体重，Myf5基因1911A>G突变显著影响韩牛的胴体重，而Myf6基因的3处突变对这7种牛的生长性能无显著影响；汤展毅等[39]采用Western 印记及RT-PCR法对成肌细胞转染牛Myf6基因后表达结果分析显示，Myf6基因转染质粒的成肌细胞后Myf6蛋白和mRNA的表达极显著提高，且Myf6基因促进成肌细胞融合形成肌管并向肌肉细胞分化；张海军等[40]采用PCR-SSCP技术研究了波尔山羊和徐淮山羊2个群体Myf6基因的PCR扩增片段，其长度为214 bp；在Myf6基因座位中，两个群体都检测到AA和AB基因，且B等位基因与A等位基因相比在DNA序列的第678处发生了一个C-A的突变，在第690处发生了一个C-G的突变，Myf6基因编码区不同基因型对波尔山羊的体高和管围指数效应有显著影响。

3.4 Myf6基因变异在其他动物上的相关研究

Hinterberger等[41]对小鼠的研究发现，Myf6的结构特征与纤维特征性状表达具有一定的关联性；Weis等[42]通过对正常成年老鼠和去神经成年老鼠肌肉中Myf6基因mRNA的表达量进行了研究，发现Myf6基因既影响成熟肌收缩蛋白和乙酰胆碱亚受体的编码，又决定着肌肉的重生和去神经后的基因活化过程；Pavlath等[43]通过对野生型老鼠局部性冻伤的咬肌和前腔骨肌与人为控制条件下转基因小鼠的咬肌和前腔骨肌在不同时段Myf6基因mRNA的表达量进行研究，发现Myf6基因在时效上的增量调节配合其他肌体特异性因子可能具有控制肌肉重生的作用。

Della等[44]对爪蟾进行研究，发现Myf6基因在爪蟾胚胎肌肉发育和再生两个阶段存在表达模式互不相同的两种功能互异的转录体，且主要在肌肉分化过程中发挥作用，与在小鼠中的作用完全不同，这项研究结果也打破了Myf6基因仅在肌分化末期发挥作用的传统观点。

4 研究Myf6基因的意义及前景

Myf6基因是现代畜禽育种中重要的候选基因之一，对肌肉生长和分化过程起着极为重要的作用，是影响畜禽肉质性状的重要功能基因之一，在挖掘畜禽的产肉潜力、提高胴体品质、加强肌肉风味物质积累方面具有重要作用。因此，研究和掌握Myf6基因的功能、结构、作用机理及遗传变异，寻找候选基因进行分子育种，辅助选择提高畜禽的产肉能力和产肉质量具有重大意义，尤其是对地方性畜禽的选育而进行的地方经济发展及地方品种开发利用和资源保护更具有不可估量的作用。

参考文献:

[1] 孙文浩, 朱 庆. 生肌决定因子Myf5基因的研究进展[J].黑龙江畜牧兽医, 2008(7): 28-30.

[2] Naidu P S, Ludolph D C, Hinterberger T J, et al．Myogenin and MEF2 function synergistically to activate the MRF4 promoter during myogenesis[J]．Mol Cell Bio, 1995, 15 (5): 2 707-2 718．

[3] Cupelli L, Renault B, Leblanc-Straceski J,et al．Assignment of the human myogenic factors 5 and 6 (MYF5,Myf6) gene cluster to 12q21 by in situ hybirdization and physical mapping of the locus between D12S350 and D12S106[J]．Cytogenet Cell Genet, 1996, 72(2-3): 250-251．

[4] Braun T, Bober E, Busechhausen-Denker G, et al．Differential expression of myogenic determination genes in muscle cells: possible autoactivation by the MYF gene products[J]．EMBO, 1989,8(12): 3 617-3 625．

[5] Braun T, Bober E, Amold H H．Myf6 a new member of the human gene family of myogenic determination factors evidence for a gene cluster on chromosome 12[J]．EMBO, 1990, 9(3): 821-831.

[6] Davis R L, Weintraub H, Lassar A B. Expression of a single transfected cDNA gonverts fibroblasts to myoblasts[J]. Cel1, 1987, 5l (6): 987.

[7] Olson E N, Brennan T J, Chakraborty T, et al. Molecular control of myogenesis:antagonism between growth and differentiation[J].Mol Cell Biochem,1991,104 (12): 7-13.

[8] Buckingham M. Molecular biology of muscle development[J]. Cell,1994, 78:15-21.

[9] Yun K, Wold B. Skeletal muscle determination and differentiation:story of a core regulatory network and its context[J]. Curr Opin Cell Biol, 1996, 8: 877-889.

[10] Bergstrom D A，Tapscott S J．Molecular distinction between specification and differentiation in the myogenic basis Helix-loop-helix transcription factor family[J]. Mol Cell Biol, 2001, 21: 2 404.

[11] Rudnick M A, Schnegelsberg P N, Stead R H, et al. MyoD or Myf5 is required for the formation of skeletal muscle[J].Cell, 1993, 75(7): 1 351-1 359.

[12] Olson E N, Awaold H H, Higby P W J, et al. Know your neighbor：three phenotypes in null mutants of the myogenic bHLH gene MRF4[J]. Cell, 1996, 85: 1-4.

[13] RudnJeki M A, Jaenisch R. The MyoD family of transcription factors and skeletal myogenesis[J]. Bioessays,1995,17:203-209.

[14] Zhu Z, Miller J B.Myf6 can substitute for myogenin during early stages of myogenesis[J]. Dev Dyn, 1997,209 (2): 233-241.

[15] Myer A, Olson E N, Klein W H. MyoD cannot compensate for the absence of myogenin during skeletal muscle differentiation in murine embryonic stem cells[J]. Dev Biol, 2001, 229 (2): 340-350.

[16] Sumariwalla V M, Klein W H. Similar myogenic functions for myogenin andMyf6 but not MyoD in diferentiated murine embryonic stem cells[J]. Genesis, 2001, 30(4): 239-249.

[17] 汤展毅, 严云勤, 高学军, 等. 牛Myf6基因克隆及在成纤维细胞中的表达[J].东北农业大学学报, 2010, 41 (11): 77-82.

[18] Rhodes S J, Konieczny S F. Identification of MYF4: a new member of the muscle regulatory factor gene family[J]. Genes Dev, 1989 (3): 2 050-2 061．

[19] Rudnicki M A, Tomin P N, Nabeshina Y. Nactivation of MyoD in mice leads to up-regulation of the myogenic HLH gene Myf5 and results in apparently normal muscle development[J]. Cell, 1992, 71 (3): 383-390．

[20] 姚守秀, 米 拉, 姚秀娟,等. 鸡胚胎期生肌调节因MY F6 的表达规律的研究[C]//中国动物遗传育种研究进展-第十五次全国动物遗传育种学术讨论会议文集，2009: 463.

[21] Molkentin J D, Olson E N. Combinatorial control of muscle development by basic helix-loop-helix and MADs-box transerlption factors[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93 (18): 9 366-9 373.

[22] Amapld H H, Braun T. Targeted inactivation of myogenic factor genes reveals their role during mouse myogenesis：a review[J]. INT J Dev Biol, 1996, 40 (1): 345-353.

[23] Tajbakhsh S, Roeaneourt D, Buckingham M,et al.Redefining the genetic hierarchies controlling skeletal myogenesis:Pax-3 and myf5 act upstream of MyoD[J]. Cell, 1997, 89 (1):127-138.

[24] Rudnieki M A,Jaenisch R.The MyoD family of transcription factors and skeletal myogenesis[J].Bio Essays,1995, 17: 203-209.

[25] 王东林, 毛宝龄. 生肌调节因子及其作用机理[J]. 国外医学分子生物学分册, 1995,17(4):157-160.

[26] 叶 鑫,王东林.生肌调节因子研究进展[J].西南国防医药, 2001,11 (6): 442-444.

[27] Daniel R, David S, Criswell J,et al. Myogenic regulatory factor during regeneration of skeletal muscle in young, adult, and old rats[J]. Journal of Applied physiology, 1993, 83 (4): 1 270-1 275.

[28] Jennugs C G．Expression of the myogenic gene MRF4 during Xenopus development[J].Dev Biol, 1992,150 (1): 121-132.

[29] Rudnicki M A ,Tomon P N, Nabeshina Y.Inactivation of MyoD in mice leads to up-regulation of the myogenic HLH gene Myf5 and results in apparently normal muscle development[J]. Cell, 1992, 71 (3): 383-390.

[30] Sumariwalla V M, Klein W H. Similar myogenic functions for myogenin and MRF4 but not MyoD in differentiated murine embryonic stem cells[J].Genesis, 2001, 30 (4): 239-249.

[31] Handel S E, Stickland N C. Muscle cellularity and its relationship with birth weight and growth[J]. J Anat, 1984, 139: 726.

[32] 田 璐, 李俊雅, 许尚忠, 等. 动物生肌决定因子的研究进展[J]. 黄牛杂志, 2005, 31 (1): 43-46.

[33] Vykoukalova Z, Knoll A, Dvorak J, et al. Linkage and radiation hybrid mapping of the porcineMyf6 gene to chromosome 5[J]. Anim Genet, 2003, 34 (3): 238-240.

[34] 朱 砺, 李学伟.Myf6基因在不同猪种的PCR-RFLP遗传多态性及其遗传效应分析[J]. 遗传, 2005, 27 (6):887-892.

[35] 任 斌. 猪AMPD1-Myf6基因的多态性及其与部分经济性状相关性研究[D].湖南长沙：湖南农业大学, 2008.

[36] Ryan A M, Schelling C P, Womack J E, et al. Chromosomal assignment of six muscle-specific genes in cattle[J]. Anim Genet, 1997, 28 (2): 84-87.

[37] Hansen G R, Abbry C A, Gaile D P,et al. Assignment of six genes to bovine chromosomes 5 and 16 by fluorescenece in situ hybridization,radiation hybrid mapping and genetic linkage analysis[J].Cytogenet Genome Res, 2007, 116 (3): 194-197.

[38] Bhuiyan M S A, Kim N K, Cho Y M, et a1. Identification of SNPs in MYOD gene family and their associations with carcass traits in cattle[J]. Livestock Science,2009, 126(13): 292-297.

[39] 汤展毅, 严云勤, 高学军, 等.牛Myf6基因真核表达载体的构建及在成肌细胞中的表达[J].中国农业科学, 2010, 43 (13): 2 793-2 799.

[40] 张海军, 陈 宏, 房兴堂. 山羊MyoD基因家族多态性及与体尺性状的相关性[J]. 遗传, 2007, 29 (9): 1 077-1 083.

[41] Hinterberger T J, Mays J L, Konieczny S F. Structure and myofiber-specific expression of the rat muscleregulatory gene MRF4[J].Gene, 1992, 117 (2): 201-207.

[42] Weis J, Kaussen M, Calvo S, et al. Denervation induces a rapid nuclear accumulation of MRF4 in mature myofibers[J].Developmental dymamics:an official publication of the American Association of Anatomists, 2000, 218 (3): 438-451.

[43] Pavlath G K, Dominov J A, Kegleg K M, et al. Regeneration of transgenic skeletal muscles with altered timing of expression of the basic helix-loop-helix muscle regulatory factor MRF4[J].The animal Journal of Pathology, 2003, 162 (5): 1 685-1 691.

[44] Della, Gaspra B, Sequeria I, et al. Spatio-temporal expression of MRF4 transcipts and protein during Xenopus laevis embryo genesis[J]. Developmental Dynamics, 2006, 235 (2): 524-529.