新型辅助性T细胞亚群Th9与相关疾病的研究进展

杨璟辉，宋少华，傅志仁

经典的免疫学理论认为，CD4+T细胞根据诱导分化条件﹑细胞因子分泌及免疫学功能的不同，可分为Th1﹑Th2﹑Th17及Treg细胞。Th1主要由IL-12诱导分化，主要分泌IL-2﹑干扰素(interferon，IFN)γ等，参与包括移植排斥反应﹑迟发型超敏性炎症反应等在内的细胞免疫，清除胞内病原体；Th2主要由IL-4诱导分化，主要分泌IL-4﹑IL-5﹑IL-6﹑IL-10等，可辅助B细胞分化，刺激B细胞增殖并产生抗体，介导体液免疫，清除胞外病原体；Th17主要由TGF-β和IL-6诱导分化，主要分泌IL-17﹑IL-17F﹑IL-22﹑IL-21等，介导炎症反应﹑自身免疫性疾病﹑移植排斥和肿瘤的发生发展；Treg主要由TGF-β诱导分化，主要分泌TGF-β﹑IL-10，介导免疫耐受及抑制抗肿瘤免疫[1-2]。随着研究的深入，科学家们又发现了一群新的以分泌IL-9和IL-10为特征的CD4+T细胞亚群——Th9，本文对这一最近发现的T细胞亚群综述如下。

1 Th9的发现

众所周知，转录因子Foxp3对Treg的产生至关重要，而TGF-β能够诱导初始T细胞表达Foxp3，并促进其向Treg分化[3]。2008年，Dardalhon等[4]研究发现IL-4能够抑制TGF-β对Foxp3的诱导作用，且可与TGF-β协同作用诱导出能够分泌IL-9和IL-10的细胞亚群。这群细胞虽然能够产生大量IL-10，却不具有免疫调节特性，相反能够诱导免疫缺陷小鼠(RAG-1-/-)发生结肠炎及外周神经炎。同年，Veldhoen等[5]发现IL-4与TGF-β具有协同作用，能够促进Th2再编程(reprogram)并分化为主要分泌IL-9的新细胞亚群。鉴于这群细胞主要分泌IL-9，在功能上又不同于经典的Th2细胞，研究者将其称为Th9。既往研究表明，IL-9可由肥大细胞﹑天然淋巴细胞﹑自然杀伤性T细胞和调节性T细胞等多种细胞分泌，主要涉及Th2细胞参与的多种免疫应答，因此一直以来，人们普遍认为IL-9是Th2类细胞因子[5]。然而，Dardalhon等[4]与Veldhoen等[5]的研究结果表明，Th9细胞虽然分泌大量的IL-9，却与Th2细胞功能迥异。进一步研究显示，这群细胞并不表达已知的Th细胞亚群特异性的转录因子T-bet(Th1)﹑GATA-3(Th2)﹑Foxp3(Treg)以及RORγT(Th17)。因此，Th9区别于以往其他的Th细胞亚群，是一类新的Th细胞亚群。

2 Th9的诱导、分化及培养

自Th9被确认为一类新的Th细胞亚群之后，研究者对其诱导﹑分化及培养途径进行了大量探索。目前，初步研究显示，体外至少有2种途径可以获得Th9。

2.1 CD4+初始T细胞分化为Th9 正如Dardalhon等[4]的研究所示，人或鼠的CD4+初始T细胞在体外IL-4和TGF-β联合刺激诱导条件下，细胞内IL-9mRNA表达升高，并且分泌大量IL-9，即Th9细胞。体外初始CD4+T细胞在IL-4或TGF-β单独存在时，仅能诱导产生少量的Th9细胞，分泌较低水平的IL-9，而在IL-4和TGF-β的联合刺激下，能够明显向Th9细胞分化，并分泌大量IL-9﹑IL-10，且IL-9产量与两者剂量呈正相关。进一步研究显示Th9细胞在分化过程中具有自分泌正反馈机制，即IL-4联合TGF-β诱导条件下加入IL-9，可使IL-9 mRNA的表达量进一步增高[4]。来源于TGF-β受体基因缺失小鼠(TGF-βRⅡ-/-)或IL-4信号细胞内传导分子STAT6基因缺失小鼠(STAT6-/-)的初始CD4+T细胞，分别在IL-4和TGF-β的诱导条件下培养，均不能产生IL-9，进一步证明了Th9细胞的分化有赖于IL-4和TGF-β的协同作用[4]。有学者利用非同步给予IL-4与TGF-β，研究Th9细胞分化时程中IL-4与TGF-β作用的差异，结果显示当延后给予IL-4时，IL-9的产生轻度下降并与延后给药时间呈线性相关，但是当延后24h给予TGF-β时，IL-9的产生则明显下降，表明IL-4参与初始CD4+T细胞分化为Th9细胞的整个时相，而TGF-β主要在最初24h内发挥刺激分化作用[4]。

2.2 Th2细胞分化为Th9 CD4+初始T细胞在Th2诱导条件下(IL-4+抗TGF-β单抗)培养1周后，采用流式技术分选出IL-4+GATA3+Th2细胞，检测发现这些Th2细胞表达IL-10﹑IL-13以及IL-5，但不表达IL-9。进一步将这些Th2细胞分别置于Th1诱导条件(IL-12)﹑Th2诱导条件(同上)以及Th9诱导条件(TGF-β)下培养，检测发现在Th1诱导条件下培养后，细胞表型及细胞因子分泌并未向Th1细胞转化，几乎不表达T-bet，而在Th9诱导条件下培养后，IL-4﹑IL-13﹑IL-5以及GATA-3的表达明显降低或缺失，IL-9的表达明显升高，IL-10有少量表达，提示Th2细胞在TGF-β的条件下可经过“重组”转变为Th9细胞[5]。Th9细胞分泌的IL-10的作用尚不明确，有研究者认为IL-10能够促进Th9细胞的产生，其他实验则证实Th9细胞培养过程中阻断IL-10R并不影响IL-9的表达。事实上，IL-10并非Th2细胞所特有，某些条件下，Th1和Th17细胞亦可表达[6-7]。因此，IL-10对于Th9细胞的作用及意义尚需进一步研究。

3 Th9分化相关因子

Th细胞亚群分化及功能维持受到相对特异性的转录因子控制，如转录因子T-bet﹑GATA-3﹑Foxp3及RORγt分别为Th1﹑Th2﹑Treg及Th17细胞活化所必需的转录因子，据此推测Th9细胞至少存在一种特异性转录因子。现有资料显示，转录因子PU.1﹑STAT6以及IRF4与Th9细胞关系较为密切。

3.1 转录因子PU.1 PU.1是ETS转录因子家族成员，可通过与DNA直接结合或与其他转录因子形成复合物的方式调节目的基因转录[8]。PU.1在Th1﹑Th2﹑Treg以及Th17细胞中表达较低甚至不表达，而在Th9细胞中呈明显高表达。研究显示，PU.1可直接连接到Th9细胞中IL-9基因的启动子上，从而促进Th9细胞分泌IL-9[9]。同时，有文献报道PU.1能够干扰转录因子GATA-3与靶基因的结合，进而抑制Th2细胞的分化发育，这一机制可以部分解释Th9诱导条件下Th2细胞向Th9细胞分化的现象[10]。PU.1基因敲除小鼠体内Th2免疫应答正常，但在变应原刺激下血清IL-9水平较野生型小鼠明显降低，由Th9细胞介导的肺炎症状也减轻，此外，在人类分泌IL-9的T细胞中抑制PU.1的表达可使IL-9分泌明显减少[10]。上述研究显示，转录因子PU.1在Th9细胞分化和功能维持中扮演着非常关键的角色，是Th9细胞所必需的转录因子[11]。

3.2 IRF4 IRF4即干扰素调节因子4，是一种分子量为52kD的转录因子，在B细胞﹑T细胞﹑巨噬细胞以及树突细胞的分化发育中发挥重要作用[12]。IRF4通常与其他转录因子形成复合物共同调节相关基因的活性，有时也能直接与基因启动子上的干扰素刺激应答元件(ISRE)结合，但亲和力较低。IRF4对于Th9细胞的分化非常重要。研究表明，Th9细胞中IL-9的分泌与IRF4的表达呈正相关。免疫共沉淀检测结果显示，IRF4能够直接与Th9细胞中IL-9基因启动子结合，促进IL-9基因转录，而IRF4基因敲除或用siRNA沉默IRF4后，CD4+初始T细胞不能分化为Th9细胞[13-14]。

3.3 STAT6 如前所述，Th细胞亚群根据所处的细胞因子环境不同而发生不同的分化。TGF-β与IL-4单独应用分别促进Treg及Th2分化，而二者协同作用则促进Th9的分化。Goswami等[15]在研究上述现象时发现，TGF-β能够促进PU.1表达及其与细胞核内目的基因的结合，而IL-4则主要活化STAT6。进一步研究显示，STAT6在抑制Th9细胞内转录因子T-bet及Foxp3表达中发挥着重要作用。同时，STAT6能够促进IRF4表达，后者具有促进Th9细胞分化的作用[16]。上述研究表明，STAT6也是Th9细胞分化的相关因子。

转录因子决定了不同细胞亚群的分化及功能，是区分不同细胞亚群的关键因素。进一步研究Th9特异性转录因子，对于明确Th9的功能及其在疾病中的作用并进行干预调控具有重要意义。

4 Th9相关疾病

4.1 Th9与哮喘 哮喘是淋巴细胞﹑嗜酸性粒细胞﹑肥大细胞等多种细胞参与的慢性气道疾病。IL-9与哮喘发病的许多重要特征有关，如血清的IgE含量升高﹑支气管上皮黏液分泌增加，呼吸道炎症﹑气道高反应性等，因此被认为是哮喘发病的重要细胞因子，在哮喘发病机制中发挥了重要作用[17]。IL-9基因位于第5号染色体长臂上(5q31-35)，与编码IL-3﹑IL-4﹑IL-5﹑IL-13﹑CD14和粒-巨噬细胞集落刺激因子(G-CSF)的基因构成基因簇，该基因簇的多态性和连锁不平衡与哮喘患者血清中总IgE含量大幅升高有关[18-19]。IL-9作用于患者体内的肥大细胞，一方面促进其增殖，另一方面促进肥大细胞在气道聚集，造成了气道对变应原的高反应性[20-22]。同时，IL-9还可以通过抑制嗜酸性粒细胞凋亡和促进IL-5介导的嗜酸性粒细胞前体成熟来增加嗜酸性粒细胞数量，增强嗜酸性粒细胞在气道内的迁移﹑聚集；诱导中性粒细胞产生炎症介质IL-8，增强嗜酸性粒细胞和中性粒细胞等介导的炎症反应。IL-9还可作用于上皮细胞而导致嗜酸性粒细胞﹑T淋巴细胞浸润，诱导上皮细胞表达产生黏蛋白，从而在哮喘炎症的发生﹑发展过程中发挥重要作用[23-24]。

4.2 Th9与自身免疫性疾病 Th9细胞在自身免疫性疾病发病过程中的作用已经受到广大研究者的注意，越来越多的研究表明，Th9正在成为治疗自身免疫性疾病的新药靶向细胞。在这类疾病过程中，一个重要的特征是Th9细胞与Th17细胞相互作用，协同促进疾病的发生﹑发展，Th9细胞分泌IL-9，后者促进Th17细胞分泌促炎因子IL-17﹑IFN-γ﹑IL-1和TNF等，共同介导炎症反应，并参与这些自身免疫性疾病的病理过程[25-27]。Th17细胞在自身免疫性关节炎(RA)中具有促进效应性T细胞活化及骨质吸收的作用，即参与了RA发病的起始和骨组织破坏两个阶段，而IL-9可通过促进CD4+初始T细胞向Th17细胞分化而参与RA的发病过程。在类风湿关节炎大鼠二次免疫时，血清IL-9升高往往伴随着转录因子STAT3的持续活化以及IL-17﹑TNF-α﹑IFN-γ等细胞因子的明显上升，表明IL-9启动了STAT3通路并促进了其他炎症介质的表达，共同参与了RA的病理过程。实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的发病过程也与IL-9有着非常密切的关系。IL-9受体缺陷以及中和IL-9能延缓疾病的发生，减轻EAE的症状，这与中枢神经系统中Th17细胞及分泌IL-6的巨噬细胞减少有关，同时也与外周淋巴结中肥大细胞的减少有关[28-29]。因此，抑制IL-9的活性或阻断其表达可能会成为治疗此类疾病的一个选择。

4.3 Th9与移植排斥反应 移植排斥反应与自身免疫性疾病在某种程度上存在相似的发病机制及免疫病理损害过程，因此，有必要探讨Th9细胞在排斥反应中的作用。已有研究表明，IL-9-/-受体小鼠移植物存活期较野生型小鼠明显延长，在MHC-Ⅱ类分子不匹配的移植模型中，转染IL-9基因的心脏供体出现急性排斥反应，伴有大量的嗜酸性粒细胞浸润，而野生型供体并不出现急性排斥反应。我们在既往的研究中发现，小鼠心脏移植术后，排斥组移植物内IL-9 mRNA的表达水平较非排斥组明显升高，脾脏CD4+T细胞内IL-9+Th9比例较非排斥组明显升高。因此，研究Th 9与移植排斥反应的关系，对于进一步认识移植排斥的发生机制具有重要意义。

5 结语及展望

Th9这一新型效应性T细胞亚群的发现，打破了人们对CD4+T细胞原有分化过程的认识，为进一步阐述过敏性疾病﹑自身免疫性疾病及移植免疫反应等多种免疫疾病的发病机制提供了新思路。同时，深入研究Th9细胞的分化及功能调控机制将为上述临床免疫疾病的治疗提供新的途径。

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