成体心肌干细胞的研究进展

郑楠，张宁坤，高连如

·综 述·

成体心肌干细胞的研究进展

郑楠，张宁坤，高连如

传统观点认为心脏是一个终末分化器官，然而随着成体心肌干细胞(CSCs)的发现，这种观点已受到广泛质疑。由于CSCs具有高度的自我更新能力和特异性心肌分化潜能，目前被认为是最有希望应用于缺血性心脏病及其他终末期心脏病替代治疗的干细胞类型。本文综述了目前关于人源CSCs、心外膜源细胞(EPDC)的研究概况，及其应用于心脏再生领域的治疗策略和研究中存在的问题。

心肌；干细胞；心包；再生

干细胞是一种具有多向分化潜能和自我复制功能的早期未分化细胞。根据在个体发育过程中出现的先后次序不同，干细胞可分为胚胎干细胞和成体干细胞[1]。当受精卵分裂发育为囊胚时，内层细胞团的细胞即为胚胎干细胞。成体干细胞是指那些具有组织或器官特异性的干细胞，具有很强的可塑性，组织来源十分广泛，其中与心肌细胞相关的有骨髓造血干细胞、外周血干细胞、脐血干细胞、骨髓间充质干细胞和骨骼肌干细胞等[2]。随着新的细胞标记物的出现及检测技术的应用，发现无论是在正常还是病理状态下，成体心肌组织中均存在具有特异性心肌分化潜能的多能干细胞，即成体心肌干细胞(cardiac stem cells，CSCs)。目前认为CSCs是指细胞膜上能够表达一种或多种干细胞相关抗原，如干细胞因子受体(C-kit)、P-糖蛋白(MDR)和干细胞抗原1(Sca-1)等多能干细胞表面标记物，同时谱系标志物阴性，且在一定条件下能够分化为各种心肌细胞的未分化细胞。CSCs的主要生物学特性包括：克隆能力；能够分化为成熟的心肌细胞、血管内皮细胞及平滑肌细胞等心脏结构细胞；可在损伤心肌局部激活、迁移[3]。根据CSCs的表面标志特征，可将其分为以下几种主要的细胞类型：边集细胞或侧群细胞(side population cells，SP细胞)、C-kit+细胞、Sca-1+细胞、LIM同源结构域转录因子Islet1+(insulin transcription factor 1，Isl1)细胞、阶段特异性胚胎抗原-1+(stage-specific embryonic antigen-1，SSEA-1)细胞、心肌球样细胞及其衍生细胞。目前在小鼠、大鼠、狗、猪的心脏中均已证实存在有CSCs。

1 人源CSCs的研究

以动物模型上CSCs的鉴定、分离、纯化、扩增研究成果为基础，目前对人源CSCs的研究已取得令人鼓舞的成果。证实人成体心脏中存在干细胞的最经典研究是2002年Quaini等[4]的体内性别交错心脏移植研究，他们将女性心脏植入男性受者，结果显示植入的女性心脏中可出现男性细胞，即在男性宿主移植的女性心脏中有大量Y染色体心肌细胞和冠脉血管，虽然这些细胞的确切来源并不清楚(可能来源于骨髓或是男性宿主残留的心脏组织)，但这并不妨碍其成为第一个证实人成体心脏中存在干细胞参与维持心脏稳态的证据。进一步的研究显示这些细胞不但构成相当比例的心肌细胞、小动脉及毛细血管，而且有助于女性供体的心脏重塑。目前在人的成体心脏中已经发现多种具有向心肌细胞方向分化特性的干细胞，如C-kit+、Sca-1+及MDR+的细胞群，研究发现它们具有很高的增殖水平，且主要分布于心房组织，表达心血管标志物如肌细胞增强因子2C(MEF2C)、GATA结合蛋白4(GATA4)及血管内皮生长因子受体-2(VEGF-2/Flk-1)，但不表达造血相关抗原[5]。

1.1 C-kit+细胞 2007年Bearzi等[6]报道利用酶消化法和免疫磁珠分选法从人梗死心肌标本中分离纯化出C-kit+CSCs，并发现这些细胞具有自我更新，生成集落和向心肌细胞、血管内皮细胞及平滑肌细胞分化的特性。在免疫抑制的大鼠心肌梗死部位局部注射C-kit+CSCs，结果产生了一个嵌合心。2年后，Bearzi等[7]又进一步研究了具有向血管内皮方向特异性分化潜能的干细胞群——C-kit+/Flk-1+CSCs，这些细胞可从人的冠脉血管壁上检测并分离纯化，将它们注入到免疫抑制的狗模型中，可形成人源的冠状动脉和毛细血管。还有研究报道C-kit+CSCs不能表达心肌干细胞标记物如MDR、Isl1和同源盒转录因子(Nkx2.5)，且被定性为肥大细胞[8]。随后Sandstedt等[9]通过组织活检从人的心房组织中分离出一小群C-kit+细胞，并通过是否表达CD45进一步细分，发现C-kit+/CD45－细胞群表达内皮祖细胞标记物如CD31、CD34、趋化因子受体(CXCR4)和Flk-1，而C-kit+/CD45+细胞群则被鉴定为肥大细胞。由FDA批准的将自体C-kit+人心肌干细胞植入到心肌梗死患者心肌中的Ⅰ期临床试验已于2009年正式启动，该试验计划从冠脉搭桥患者的心脏活检组织中分离出C-kit+CSCs，3～4个月后将这些细胞重新经心导管注入到患者心脏组织中以期改善其临床预后，目前该试验正在进行中。

1.2 Sca-1+细胞 Sca-1是ly-6家族中的一员，是造血干细胞的一种表面标记物。心肌中Sca-1+细胞是指表面携带Sca-1的心肌前体细胞，当与成人心肌细胞共培养或在骨形成蛋白(BMP)-2、纤维生长因子(FGF)-4或8、Wnt拮抗剂Dickkopf-1及5-氮胞苷等诱导下可分化为功能性心肌细胞，并表达心肌早期转录因子及特异性结构蛋白[10]。目前值得关注的是，人类不含Sca-1基因，但通过啮齿动物Sca-1抗体却可以分选出胎儿以及成人心脏组织中的Sca-1+细胞，Goumans等[11]还报道从人心脏中分离出的Sca-1+细胞不需要与新生心肌细胞共培养，只要通过刺激转化生长因子-β(TGF-β)就能形成功能性心肌细胞。

1.3 心肌球样细胞(cardiosphere cell，CS)及其衍生细胞(CDCs) 人及小鼠心脏活检标本经酶消化后均可产生一组外形小、圆、亮的未分化细胞，在体外可自发黏附聚集形成细胞团样结构，称之为CS。将这些细胞体外分离后，经检测一小部分表达干细胞表面标记物(C-kit、Sca-1、CD34)和内皮细胞标记物(Flk-1、CD31)，但是经过6d的培养后，仅有主要表达C-kit的细胞存留下来，这说明C-kit+细胞可能对于CS的持续扩增起主要作用[12]，据此目前比较公认的观点是CS的核心由增殖型的C-kit+细胞构成。在体外，小鼠源CS细胞可自发搏动，而人源CS细胞需要与大鼠心肌共培养后才能具有上述特性；在体内，人类CS及CDCs在注射入免疫缺陷小鼠的梗死心肌后能够分化成心肌细胞、内皮细胞和平滑肌细胞[12]。Smith等[13]还报道了有效分离人CDCs的方法，并且再次证明了其在体内外的心源特性。这些结果表明CS与驻留在成体心脏中的多潜能干细胞特性相一致。更重要的是有报道CDC技术已进入到Ⅰ期临床试验阶段[14]。

2 心外膜CSCs的研究

除了心肌组织外，成体心脏中还有一个重要的CSCs组织来源——心外膜。心外膜及其衍生物在冠脉血管形成及心肌发育过程中都发挥了重要作用，并且在成体心脏中仍保留了再生潜力[15]。

2.1 心外膜源细胞(epicardium-derived cell，EPDC)的形成 心外膜绝大多数来源于前心外膜(proepicardium，PE)。目前对于PE形成的最新认识是其发源于心管流入极(inflow pole)心肌层后缘[16]，PE形成后随之出现迁移，最终覆盖于心脏表面形成心外膜。心外膜的上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition，EMT)发生在房室结、心室以及心室-流出道交界处，并不出现在心房[17]，最终形成EPDC。

2.2 EPDC的分化 EPDC在心外膜下层环境开始迁移和分化，目前的共识是其可分化形成心肌成纤维细胞、平滑肌细胞，并可能分化为内皮细胞。在相当长一段时间内EPDC被认为是冠状动脉系统的源头，然而谱系追踪小鼠表明：虽然PE产生血管平滑肌和大约4%的心肌，但是对于冠脉内皮细胞的贡献却很少[18-19]。最新认识是由Red-Horse等[20]提出的静脉细胞“去分化-再分化”假说，认为静脉窦心内膜层是冠脉内皮的来源，但该结论尚需进一步确认。

2007年，Winter等[21]从成人心房组织中分离出EPDC，该细胞表达平滑肌α-actin和vW因子、肌质网Ca2+ATP酶以及电压门控Na+通道，将GFP+EPDC植入免疫缺陷小鼠心肌梗死区后2周，梗死区心肌再生明显，毛细血管密度增加，心室发生重构，心功能改善。但至今对于成年期的心外膜细胞能否转化为心肌细胞仍存在争议[22-23]。最近Chong等[24]报道了PE来源的心脏驻留干细胞，称之为心脏驻留集落形成单元成纤维细胞。Kuhn等[25]认为心外膜下层是新生心肌细胞的来源，心外膜提供心肌干细胞的“生态位”/巢(niche)。目前比较一致的观点是，在心脏再生过程中，心外膜细胞从休眠状态中激活，形成冠脉血管重建和心肌修复的生态位，从而启动心脏修复过程。EPDC可以分化形成心脏成纤维细胞和平滑肌细胞，因此作为多种心脏细胞世系的来源，心外膜在心脏再生领域有很大的潜在价值。

3 心脏再生的应用策略

目前干细胞应用于临床的主要难题包括足够数量的干细胞的获得，特异性分化诱导，临床试验或应用结果的判断标准，政府及部门科研政策与管理等诸多方面[26]。然而事实上，活体组织中也只有很少数量的CSCs存在，因此扩增CSCs以达到临床需求对于心脏再生领域的研究和治疗来说尤其重要。目前主要有两种不同的策略：第一种是基于心脏活检后的体外分离与扩增，再将扩增的CSCs植入到受损心脏；第二种是将重点集中在利用特殊效应因子刺激动员体内CSCs的扩增。

3.1 策略的选择 第一种策略需要微创外科操作，并且需要将相当长的一段时间消耗在体外扩增上(这些体外操作可能会影响到干细胞表型)，此外对于将体外扩增的CSCs植入到缺血心脏的最佳途径目前仍未取得共识，虽然在动物模型上植入CSCs取得了一定的预期效果，但真正嫁接到梗死心肌的有活性的CSCs比例仍然很低。鉴于以上考虑，第二种治疗策略可能更适于临床应用，因为它可以避免细胞植入途径的选择、植入细胞存活率低以及宿主免疫排斥等问题。

驻留在心肌生态位的CSCs保持着一定的稳态，它们被受损心脏激活和招募的能力取决于周围组织释放的因子(factors)水平，内源性CSCs在梗死边界区较梗死区表现出更强的增殖潜力[27]，这可能是因为梗死区损伤程度过大，超过了内源CSCs的修复能力，并且梗死区形成的纤维组织限制了缺氧细胞趋化因子的释放，进而影响到CSCs从干细胞巢迁移至受损心肌部位的能力。利用特殊效应因子激活CSCs并提高其迁移至受损心肌区域和适应不利环境的能力，能更加有效地修复损伤心肌。

3.2 策略的应用 目前已有一些研究证实诸如肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)和表皮生长因子(EGF)等可影响CSCs的迁移、扩增及分化能力[28-30]。胸腺素β-4(thymosin beta-4，Tβ-4)是一种由43个氨基酸残基组成的肌动蛋白单体结合蛋白，很早就有学者证实其具有重要的刺激冠脉血管生成，以及在心肌受损后促进心肌细胞和内皮细胞迁移、生存，并维持血管生成等作用[31-32]，而且还可激活静止状态的EPDC，促进其分化为成纤维细胞、平滑肌细胞和血管内皮细胞[15]。目前国外对于apelin/APJ在胚胎心肌分化中的作用研究日益增多，在小鼠心肌梗死模型[33]及缺血再灌注模型[34]中，免疫荧光标记及流式细胞检测显示，给予外源性apelin可动员体内具有向心肌血管内皮方向分化潜能的CD133+/C-kit+/Sca-1+和C-kit+/Flk-1+干细胞群，且2周后梗死区面积缩小，毛细血管密度增加，心功能得到改善。

上述研究结果表明，采用特殊因子原位激活CSCs相比于体外分离扩增植入策略更加简便易行，可以作为一种有效的干细胞治疗策略。

4 问题与展望

虽然目前对于CSCs的研究已取得了一定成果，但仍然存在以下几方面的问题有待解决：①CSCs是胚胎发育过程中存留下来的具有向心肌组织特异性分化的干细胞群还是被动员至心脏的骨髓源性细胞成分；②表达不同表面标记物的CSCs群是否具有不同的分化潜能；③CSCs自身的稳态平衡和动态变化以及在体内被激活的具体生物学机制；④CSCs在成体心脏中长期存在的稳定性及分化后的功能如何。这些问题的全面阐释将有助于确定适当的调控因素以及优化利用CSCs的巨大潜能，从而实现高效的心肌再生。我们相信，随着研究的逐步深入，成体CSCs作为一种治疗手段将会具有广阔的应用前景。

[1] Luo T, Li YM. Electrophysiological effects and arrhythmogenic mechanisms in cardiac stem cell transplantataion[J]. Acta Acad Med CPAPF, 2007, 16(5): 576-579. [罗涛, 李玉明. 心脏干细胞移植电生理效应及其致心律失常机制[J]. 武警医学院学报, 2007, 16(5): 576-579.]

[2] Gao LR. Progress and mechanism of stem cell transplantation in the treatment of ischemic heart disease[J]. J Clin Rehabil Tissue Eng Res, 2007, 11(46): 9346-9352. [高连如. 干细胞移植治疗缺血性心脏病进展及其作用机制[J]. 中国组织工程研究与临床康复, 2007, 11(46): 9346-9352.]

[3] Leri A, Kajstura J, Anversa P. Cardiac stem cells and mechanisms of myocardial regeneration[J]. Physiol Rev, 2005, 85(4): 1373-1416.

[4] Quaini F, Urbanek K, Beltrami AP, et al. Chimerism of the transplanted heart[J]. N Engl J Med, 2002, 346(1): 5-15.

[5] Urbanek K, Quaini F, Tasca G, et al. Intense myocyte formation from cardiac stem cells in human cardiac hypertrophy[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2003, 100(18): 10440-10445.

[6] Bearzi C, Rota M, Hosoda T, et al. Human cardiac stem cells[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2007, 104(35): 14068-14073.

[7] Bearzi C, Leri A, Lo MF, et al. Identification of a coronary vascular progenitor cell in the human heart[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2009, 106(37): 15885-15890.

[8] Pouly J, Bruneval P, Mandet C, et al. Cardiac stem cells in the real world[J]. J Thorac Cardiovasc Surg, 2008, 135(3): 673-678.

[9] Sandstedt J, Jonsson M, Lindahl A, et al. C-kit+CD45－cells found in the adult human heart represent a population of endothelial progenitor cells[J]. Basic Res Cardiol, 2010, 105(4):545-556.

[10] Wang X, Hu Q, Nakamura Y, et al. The role of the sca-1+/CD31－cardiac progenitor side population in postinfarction left vent ricular remodeling[J]. Stem Cells, 2006, 24(7): 1179-1788.

[11] Goumans MJ, de Boer TP, Smits AM, et al. TGF-beta1 induces efficient differentiation of human cardiomyocyte progenitor cells into functional cardiomyocytes in vitro[J]. Stem Cell Res, 2007, 1(2): 138-149.

[12] Messina E, De Angelis L, Frati G, et al. Isolation and expansion of adult cardiac stem cells from human and murine heart[J]. Circ Res, 2004, 95(9): 911-921.

[13] Smith RR, Barile L, Cho HC, et al. Regenerative potential of cardiosphere-derived cells expanded from percutaneous endomyocardial biopsy specimens[J]. Circulation, 2007, 115(7): 896-908.

[14] DavisDR, ZhangY, Smith RR, et al. Validation of the cardiosphere method to culture cardiac progenitor cells from myocardial tissue[J]. PLoS One, 2009, 4(9): e7195.

[15] Smart N, Risebro CA, Melville AA, et al. Thymosin beta4 induces adult epicardial progenitor mobilization and neovascularization[J]. Nature, 2007, 445(7124): 177-182.

[16] van Wijk B, Van den Berg G, Abu-Issa R, et al. Epicardium and myocardium separate from a common precursor pool by crosstalk between bone morphogenetic protein-and fibroblast growth factor-signaling pathways[J]. Circ Res, 2009, 105(5): 431-441.

[17] Wessels A, Perez-Pomares JM. The epicardium and epicardially derived cells(EPDCs) as cardiac stem cells[J]. Anat Rec A Discov Mol Cell Evol Biol, 2004, 276(1): 43-57.

[18] Cai CL, Martin JC, Sun Y, et al. A myocardial lineage derives from Tbx18 epicardial cells[J]. Nature, 2008, 454(7200): 104-108.

[19] Zhou B, Ma Q, Rajagopal S, et al. Epicardial progenitors contribute to the cardiomyocyte lineage in the developing heart[J]. Nature, 2008, 454(7200): 109-113.

[20] Red-Horse K, Ueno H, Weissman IL, et al. Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells[J]. Nature, 2010, 464(7288): 549-553.

[21] Winter EM, Grauss RW, Hogers B, et al. Preservation of left ventricular function and attenuation of remodeling after transplantation of human epicardium -derived cells into the infarcted mouse heart[J]. Circulation, 2007, 116(8): 917-927.

[22] Smart N, Bollini S, Dube KN, et al. De novo cardiomyocytes from within the activated adult heart after injury[J]. Nature, 2011, 474(7353): 640-644.

[23] Zhou B, Honor LB, Ma Q, et al. Thymosin β4 treatment after myocardial infarction does not reprogram epicardial cells into cardiomyocytes[J]. J Mol Cell Cardiol, 2012, 52(1): 43-47.

[24] Chong JJ, Chandrakanthan V, Xaymardan M, et al. Adult cardiacresident MSC-like stem cells with a proepicardial origin[J]. Cell Stem Cell, 2011, 9(6): 527-540.

[25] Kuhn EN, Wu SM. Origin of cardiac progenitor cells in the developing and postnatal heart[J]. J Cell Physiol, 2010, 225(2): 321-325.

[26] Li J, Hou J, Hu M. Hot spots in fundamental stem cell research and their difficulties in application studies[J]. Med J Chin PLA, 2012, 37(6): 659-661. [李进, 候俊, 胡敏. 干细胞基础研究热点及应用难题[J]. 解放军医学杂志, 2012, 37(6): 659-661.]

[27] Urbanek K, Torella D, Sheikh F, et al. Myocardial regeneration by activation of multipotent cardiac stem cells in ischemic heart failure[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2005, 102(24): 8692-8697.

[28] Rota M, Padin-Iruegas ME, Misao Y, et al. Local activation or implantation of cardiac progenitor cells rescues scarred infarcted myocardium improving cardiac function[J]. Circ Res, 2008, 103(1): 107-116.

[29] Aghila Rani KG, Kartha CC. Effects of epidermal growth factor on proliferation and migration of cardiosphere-derived cells expanded from adult human heart[J]. Growth Factors, 2010, 28(3): 157-165.

[30] Rosenblatt-Velin N, Lepore MG, Cartoni C, et al. FGF-2 controls the differentiation of resident cardiac precursors into functional cardiomyocytes[J]. J Clin Invest, 2005, 115(7): 1724-1733.

[31] Kupatt C, Bock-Marquette I, Boekstegers P. Embryonic endothelial progenitor cell mediated cardioprotection requires Thymosin beta4[J]. Trends Cardiovasc Med, 2008, 18(6): 205-210.

[32] Bock-Marquette I, Shrivastava S, Pipes GC, et al. Thymosin beta4 mediated PKC activation is essential to initiate the embryonic coronary developmental program and epicardial progenitor cell activation in adult mice in vivo[J]. J Mol Cell Cardiol, 2009, 46(5): 728-738.

[33] Li L, Zeng H, Chen JX. Apelin-13 increases myocardial progenitor cells and improves repair postmyocardial infarction[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2012, 303(5): 605-618.

[34] Tempel D, de Boer M, van Deel ED, et al. Apelin enhances cardiac neovascularization after myocardial infarction by recruiting Aplnr+ circulating cells[J]. Circ Res, 2012, 111(5): 585-598.

Research progress of adult cardiac stem cells

ZHENG Nan1, ZHANG Ning-kun2, GAO Lian-ru2*
1Heart Center of Naval Clinical Medical College, Second Military Medical University, Beijing 100048, China
2Department of Cardiology, Navy General Hospital, Beijing 100048, China
*

, E-mail: lianru@yahoo.com.cn
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (81170094)

The traditional view is that the heart is a terminal organ. This dogma, however, has been widely questioned with the discovery of adult cardiac stem cells (CSCs). Since CSCs have a highly self-renewal capacity and specific myocardial differentiation potential, nowadays they have been regarded as the most promising type of stem cells used in ischemic heart disease and other replacement therapy of end-stage heart disease. The present paper will focus on current results of scientific research on human adult CSCs and epicardium-derived cell (EPDC), as well as the treatment strategies in the field of cardiac regeneration, and the problems and prospect disclosed in the research.

myocardium; stem cells; pericardium; regeneration

R329.28；R331.31

A

0577-7402(2013)04-0334-04

2013-01-06；

2013-03-11)

(责任编辑：张小利)

国家自然科学基金(81170094)

100048 北京 第二军医大学海军临床医学院心脏中心(郑楠)；100048 北京 海军总医院心脏中心(张宁坤、高连如)

高连如，E-mail：lianru@yahoo.com.cn