滇结香花对α葡萄糖苷酶的抑制活性

耿 燕， 阳红梅， 许泓瑜， 史劲松

（江南大学 药学院，江苏 无锡214122）

滇 结 香 （Edgeworthia gardneri （Wall.） Meissn）主要产于西藏和云南地区[1-2]，其俗名为西藏绿萝花，据《藏医养身图说》，主治糖尿病、冠心病、高血压、高血脂、血管炎及脉管炎等。 结香花（Edgeworthia chrysantha） 常作为密蒙花（Buddliga officinalis）的伪品进行销售[3-4]。而绿萝花为天南星科（Araceae）植物，与结香在外形上差异很多，二者混淆的原因可能在于“夢（梦）花”与“萝花”的误读和误解[5]。目前，据国内外文献报道，已从结香中分离出的化合物主要有香豆素类、黄酮类、甾类、有机酸及含氮化合物等，具有抗菌、消炎和镇痛的作用[1-2]。西藏当地居民将滇结香花通过泡水饮用的方式来治疗糖尿病等慢性疾病，但未探明作用机理。有文献报道，结香中的瑞香黄烷素能抑制肠道上皮的α葡萄糖苷酶活性[6]，抑制小肠α葡萄糖苷酶活性是药物降血糖机理之一[7-9]，故拟通过研究西藏产滇结香花提取物对α葡萄糖苷酶活性的影响来探寻其活性物质。滇结香花在民间有广泛的用途，但笔者未见对其安全性评价的资料，作者通过对其活性较好的组分进行体内急毒评价，并在小鼠高血糖模型基础上研究其降糖活性，为深入开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂

滇结香（西藏绿萝花），由西藏月王生物科技有限公司提供；经鉴定为滇结香，为瑞香科、结香属植物，标本保藏于中国科学院昆明植物研究所植物标本室。阿卡波糖，购自德国拜尔公司；α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase，EC 3.2.1.20）、4-硝基苯 a-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG），购自sigma公司；谷丙转氨酶试剂盒及谷草转氨酶试剂盒，购自南京建成科技有限公司；其余试剂为分析纯，购自国药集团化学有限公司。

1.2 实验动物

6～8周昆明小鼠，购自上海斯莱克动物实验中心（合格证号:SCXK（沪）2003-0003）；健康雄性 SD（Sprague Dawley）大鼠，体重 200～240 g ，3 月龄，购自上海斯莱克动物实验中心（合格证号:SCXK（沪）2007-0005）。

1.3 仪器

EL204型电子天平，博特勒托利多公司制造；UV-2100型紫外分光光度计，上海UNICO仪器有限公司制造；GZX-9070MBE数显鼓风干燥箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂制造；RE-52A旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器有限公司制；恒温水浴循环锅，美国POLYSCIENCE制；SpectrAA 220型原子吸收分光光度计，Varian公司制；UV1800型紫外分光光度计，上海美诺达科技有限公司制；Triad冷冻干燥仪，美国 Labeonco公司制；MULTISKAN ASCENT酶标仪，赛默飞世尔仪器有限公司制。

2 方法

2.1 α-葡萄糖苷酶体外抑制实验

分别选用Sigma公司的酵母源α-葡萄糖苷酶及自提的大鼠α-葡萄糖苷酶，提取方法参考文献[10]。对α-葡萄糖苷酶抑制作用的具体实验方法及数据处理见文献[11]。

2.2 小鼠急性毒性实验

选取正常昆明小鼠，随机分为4个剂量组（n=10），雌雄各半，共8组，灌胃给药:正常对照组；滇结香水提物（EMW）给药组（1 000、2 500、5 000 mg/kg）。观察14 d后，通过摘眼球的方式采取动物的血液，静置 3～4 h，血液分层后，2500 r/min 离心 40 min，取上清液，以备血清生化学指标检测，然后将各组动物处死，摘取小鼠肝脏等器官，冲洗干净并称重。血清中谷草转氨酶与谷丙转氨酶的测定按试剂盒说明。动物颈椎脱臼处死，观察心、肝、肾、肺、脾、脑、胃等器官的体积、颜色、质地及质量等的改变，计算器官指数。器官指数=器官质量/小鼠体质量。

2.3 高血糖模型的建立

90只4周龄雄性昆明小鼠禁食12 h后剪尾取血，用Free-style血糖试纸测定基础血糖水平，随机分为正常对照组（10只）和模型组（80只）。模型对照组根据体重左下腹腔注射ALX 150 mg/kg，正常对照组注射生理盐水，观察3 d。在给药第4天后血糖上升到（7.5±1.237）mmol/L，再次注射 50 mg/（kg·d），测定空腹血糖水平，第7天测定其血糖，血糖水平≥11.1 mmol/L确定为高血糖模型。建模成功率为70%。将建好的糖尿病动物模型随机分为EMW高剂量组（300 mg/kg）、EMW 中剂量组（200 mg/kg）、EMW低剂量组 （100 mg/kg）、阿卡波糖对照组（20 mg/kg）、生理盐水对照组。实验期间观察小鼠皮毛、进食、饮水、尿量、体重等生理情况。给药后0、0.5、1、2、3、4、5、6 h 采集血样， 血糖仪测定血糖值。计算给药后不同时间的血糖质量分数，即

各组分给药后0 h血糖质量分数为100%。

2.4 数据统计

根据One-Way ANOVA统计学处理实验结果，结果用平均值±标准差（mean±SD）标示，显著水平为p＜0.05。

3 结果与分析

3.1 滇结香花活性物质的粗提

称取150 g滇结香花，按溶剂的极性大小不同，选择正己烷、石油醚、乙酸乙酯、甲醇、水1 500 mL依次提取2 h，每种溶剂提3次，合并提取液，抽滤掉滇结香花渣滓，滤液旋转蒸发浓缩至适宜体积。浓缩后有机溶剂粗提物用离心浓缩仪离心浓缩至粉末，水粗提物用冻干机冻干至粉末，备用。滇结香花的正己烷提取率为7.34%、石油醚提取率为14.13%、乙酸乙酯提取率为8.74%、甲醇提取率为11.08%、水提取率为12.24%。

3.2 滇结香花各溶剂粗提取物对α-葡萄糖苷酶抑制作用的初步研究

分别测定滇结香花的 5种提取物和阳性对照阿卡波糖在相同系列质量浓度下（1 000 mg/kg、1 500 mg/kg、2 000 mg/kg）其对酵母源与大鼠源α葡萄糖苷酶的抑制活性。表1显示各粗提物在不同筛选浓度下，抑制效果变化不大，除正己烷提取物外，质量浓度1 000 mg/kg时，其它 5种提取物对酵母来源α葡萄糖苷酶的抑制活性均高于阳性对照药阿卡波糖（（30.67±1.32）%），且存在显著差异（p＜0.05或p＜0.01）。 而对大鼠源α葡萄糖苷酶，仅有水提物的抑制活性（（34.20±1.36）%）高于阿卡波糖（（28.80±1.78）%），且存在显著差异（p＜0.05）。 表明仅有EMW质量浓度1 000 mg/kg时具有较好的酵母源和大鼠源α葡萄糖苷酶抑制活性。有文献报道，酵母来源α葡萄糖苷酶体外抑制实验存在一定的假阳性情况[8-9]，应优先考虑采用动物来源的α葡萄糖苷酶，综合考虑，滇结香花水提取物体外抑制活性最好。

表1 滇结香花提取物对酵母和大鼠来源α-葡萄糖苷酶的体外抑制活性Table 1 Yeast and rat intestinal α-glucosidase inhibitory activity of different extracts from E.gardneri in vitro

3.3 滇结香花水粗提取物急性毒性作用初步研究

选择有较明显抑制α-葡萄糖苷酶活性的水提物进行急性毒性初探。经预试，无法做出LD50，滇结香花水提取物致死量大于5 000 mg/kg，毒性较低。不同滇结香水提物给药组（1000、2500、5 000 mg/kg）一次给药观察14 d期间小鼠的死亡率为0。小鼠饮食、饮水、体重、皮毛与正常组比较，没有统计学差异。其谷丙转氨酶（GPT）和谷草转氨酶（GOT）的活性与正常组比较（图1），没有显著差别。心、肝、肾、肺、脾、脑、胃等器官指数显示（表2-3），滇结香花水提物无明显的器官毒副作用。

图1 滇结香花水提物一次灌胃14 d后对小鼠GOT和GPT的影响Fig.1 Effect of oral administration of EMW once on the activity of GOT and GPT in mice after 14 days

表2 雄性小鼠一次灌胃滇结香花水提物14 d后其器官指数（mean±SD，n=10）Tab.2 Organ index of oral administration of EMW once in male mice after 14 days （mean±SD，n=10）

3.4 滇结香花水提物对高血糖模型组小鼠的影响

滇结香花水提物在体外有较高的α-葡萄糖苷酶活性抑制作用且无明显毒副作用，进一步在动物整体水平考察其降血糖的活性。如图2所示，阿卡波糖给药0.5 h后即可下调高血糖模型小鼠血糖水平，给药1～3 h血糖下降幅度最大，与对照组相比存在显著差异 （p＜0.05），给药4 h后血糖回升至0 h浓度。EMW高中低剂量给药在1 h后都可下调小鼠血糖水平，但低剂量（100 mg/kg）给药3 h后血糖回升至原来浓度。EMW中剂量给药（200 mg/kg）3 h后小鼠血糖下降幅度最大，2～4 h小鼠血糖质量比数对照组相比存在显著差异（p＜0.05），5 h后血糖回升至0 h浓度。EMW高剂量给药（300 mg/kg）4 h后血糖下降幅度最大，2～5 h与对照组相比存在显著差异（p＜0.05），给药6 h后血糖回升至0 h浓度。滇结香花水提物对高血糖模型小鼠的降血糖幅度大小、药效持续时间与给药浓度成正比，与阳性药物相比对血糖控制作用更持久并且效果温和。

表3 雌性小鼠一次灌胃滇结香花水提物14 d后其器官指数（mean±SD，n=10）Tab.3 Organ index of oral administration of EMW once in female mice after 14 days（mean±SD，n=10）

图2 滇结香花水提物对高血糖模型小鼠血糖的影响Fig.2 Effect of EMW on the blood concentration in hyperglycemia mice

4 结语

目前医学界已将α-葡萄糖苷酶抑制剂列为第3类口服降糖药[12]。此类药物对一、二型糖尿病均适用。代表药物如阿卡波糖，其作用机制为抑制位于小肠绒毛上皮细胞刷状缘的α-糖苷酶的活性从而抑制二糖和低聚糖降解为单糖如葡萄糖，进而延缓葡萄糖的吸收，并转化葡萄糖依赖的肠激素的释放，但其有腹部不适、腹泻、胃肠胀气等不良反应。中药等天然药物降血糖疗效明确，副作用小[13]，作者采用α葡萄糖苷酶体外抑制模型对产于西藏地区的滇结香花进行降糖活性组分筛选，结果表明，滇结香花水提取物体外抑制活性最好。小鼠急性毒性实验表明滇结香花水提取物无明显毒副作用，且水提物对小鼠高血糖模型有一定的降糖作用，故可对该提取物进行进一步分离纯化，追踪其活性成分，并在动物整体水平评价其降糖作用，进而研究其调节血糖的机制，这些研究将有助于开发治疗糖尿病的新药。

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