分子病理学在骨肿瘤诊断中的应用进展

许 猛 综述 王 岩 审校

解放军总医院 骨科，北京 100853

随着肿瘤遗传学的进步，特异基因的改变已经在病理实验室的日常诊断中得以应用。因此，分子诊断在骨肿瘤的分型中发挥着越来越重要的作用。研究表明，所有尤文氏肉瘤和近70%的低分化动脉瘤样骨囊肿都有染色体易位，包括EWSR1基因或USP6(TRE17)基因等。而对于骨肉瘤和高分化软骨肉瘤，基因组的不稳定和复杂基因组型的参与也是导致发病的最关键环节。现已被证实的前列腺癌中基因融合的高发生率(79%)启示在骨肿瘤中存在更多隐性染色体失常[1]。最近确定了两个新发现的复杂融合产物：间叶软骨肉瘤HEY1-NCOA2融合基因； 上皮样血管内皮瘤中t(1；3)(p36；q25)易位导致的WWTR1-CAMTA1融合，包括骨[2-5]。本综述将介绍多种用于探索骨肿瘤基因改变的技术，并评论一些现存的骨肿瘤不同基因亚型的分型标准。

1 检测细胞遗传学变异的分子技术

1.1 传统显带和多色荧光原位杂交技术 依赖增殖细胞中期技术，传统的细胞遗传学研究曾是探索复杂染色体改变的重要探索工具。人染色体核型分析为肿瘤相关基因结构和数量的改变提供了全基因扫描。这些试验适用于探索未知的遗传物质改变，这些改变转而实现了特征识别以及肿瘤相关染色体重排。例如复杂易位已被用于标示断点跨越基因。以细胞中期为基础的人类染色体核型分析有两个主要的局限性： 1)对有活力的分裂细胞的依赖； 2)解决的问题有限。在一些临床环境下，新鲜有活力的标本是不可用于试验的，这些就阻碍了染色体核型分析。对于大多数的实性肿瘤，染色体的复杂性是不断改变的，细胞中期染色体的质量较低也阻碍了相关染色体片段的识别。最新研究显示，在预处理切除标本不可用的情况下，培养粗针活检标本要优于培养细针活检标本[6]。多色荧光原位杂交(M-FISH)人类染色体核型分析是通过应用特异性全染色体着色探针组，使每个染色体都被标记了一个特定的颜色。这种核型分析提高了染色体重排的检测敏感性，例如，联合二进制比率标签免疫荧光原位杂交(COBRA-FISH)核型分析[7]。然而，由于价格昂贵，而且需要特殊材料，这些试验未被广泛使用。从诊断学的角度，多数已被识别的易位类型的特异性诊断试验(FISH和RT-PCR，详见后述)已经得到了发展。这些诊断试验有着很高的敏感性和特异性，并且可以在现有材料上应用。这些诊断试验(FISH和RT-PCR)的高选择性排除了对结果有影响的肿瘤相关的次生改变检测。

1.2 阵列比较基因组杂交技术 近十年，阵列比较基因组杂交技术已成为检测基因改变(基因的延长或消失)的强大技术。这种技术已成功用于研究先天的(种属性的)和后天获得(肿瘤相关)基因研究。常规应用中的一些参数，例如阵列试验分辨率(芯片上报告元件的数量)、样本特性(腐败或新鲜)、样本纯度(肿瘤细胞比例)等都很重要。已推广的阵列平台最初是为扫描基因改变而设计的，因此在外显子-内含子水平上的个体基因改变的检测方面所提供的信息是有限的。为了弥补这种局限性，人们开始应用寡核苷酸微阵列比较基因组杂交的方法。可以用此方法检测和定位目标基因中与外显子大小相类似的片段改变，在后天或先天基因中都可以应用[8-9]。这项技术使经过脱钙、甲醛固定、石蜡包埋骨组织的DNA萃取物的分析成为可能[10]。阵列比较基因组杂交技术被寄希望于可直接应用于诊断，对于拷贝数改变的检测，尤其是当包括多对基因座或变化基因的长度可变时，阵列比较基因组杂交技术会优于FISH技术。已经证实CDKN2A/2B区域纯合子缺失使各型肿瘤的预后都较差，而在实例中，常规FISH探针组检测显示出相反的结果。假阴性结果或许是由FISH探针覆盖了部分基因区域的微缺失造成的。由于这些微缺失(5~10 kb)会比实际的探针(90~150 kb)小，因此在这种方法下，微缺失仍检测不到。其他技术，如arrayCGH或多重连接依赖式扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)已可应用于检测微缺失[11-12]。这些检测方法已在先天基因(一般的微缺失和重复综合征基因区域)中体现了优越性。另外，arrayCGH不能用于检测平衡易位基因。

2 易位检测

2.1 荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)FISH可以在探针覆盖断点或与断点侧面相接的情况下识别特异性易位。易位断点则使区别标记探针组(以红绿常见)显现出了不同颜色。如果可以得到甲醛固定、石蜡包埋的组织标本，那么FISH就是最佳选择。FISH最大的一个优势在于它可以检测出非分裂相(细胞间期)细胞胞核内的染色体易位，这种细胞可来源于新鲜、冰冻或甲醛固定石蜡包埋的肿瘤组织标本。同时，FISH也可用于仅有甲醛固定石蜡包埋标本的检测。然而，FISH在石蜡包埋标本上并不是屡试不爽的，甚至会失败，尤其是在标本被甲酸或醋酸脱钙的情况下。FISH对杂质的敏感性较RT-PCR差。用分裂FISH探针组做的诊断试验不能显示易位基因的原始位置。这或许与含有EWSR1基因的肿瘤组织有很大的相关性。这个位点的出现是偶然的，并且与临床表现不典型的骨肿瘤、软组织肿瘤多样性有关系。为了找出易位基因的准确易位点，还应当进行附加试验(协同定位探针组或下文介绍的在RT-PCR基础上的试验)。同时，FISH试验结果还应从组织学和免疫组化的角度进行解释。

2.2 反转录聚合酶链式反应(reverse transcriptase-PCR，RTPCR) 当运用新鲜冰冻标本时，RT-PCR是首选试验。RTPCR可用于大多数易位形成的可转录嵌合基因的检测。对于RT-PCR来说，RNA是必要的，且可以从冰冻肿瘤标本中分离出来。从甲醛固定石蜡包埋的骨肿瘤组织标本中分离RNA的过程会受到脱钙过程的严重影响，因此可用冷冻标本。这种技术的优势在于其只需很少一部分组织材料，使得极少量的活体组织切片和抽取物都可用。还应当注意到融合基因的多样性，例如，尤文氏肉瘤有18种不同的嵌合基因转录物被描述为EWSR1-FLI1，这些都应当在设计引物时加以考虑。检测产物定序需要在外显子水平识别易位基因。RT-PCR会遗漏新的或很少出现的转录产物。

2.3 突变检测 基因中核苷酸置换的检测方法取决于核苷酸置换是否具有复杂性、特异性，还是散在分布于编码序列的全长。检测一个变异序列的最直接方法就是热点突变，热点突变主要是用来筛选致癌基因中单核苷酸替代物。这些突变通过一种显性机制激活基因，因此其在变异中的作用是有限的。最近报道的软骨肉瘤IDH1热点突变，即为一含有很少核苷酸替代物的基因，但是这些替代物很可能就是导致肿瘤发生的启动子[13-14]。特异的核苷酸置换可被强大且敏感性极高的方法检测出来，这些方法可检测出被非肿瘤组织(如基质或炎性浸润)严重污染的标本中的单个核苷酸置换。这些方法包括： 水解探针实时PCR和焦磷酸测序技术，以及分光仪和斯卡帕基因分型[15-17]。每种方法致力于检测一个既定核苷酸替代物或小基因缺失、插入基因。

抑癌基因失活的筛查通常需要非常复杂的程序(包括扫描完整基因序列)，这是由于热点突变不是频繁发生的。对于某些基因，热点区域已被确定，比如TP53。这个所谓的“基因组卫士”通常在外显子5-外显子8的区域突变。外显子热点突变检测的失败使得剩余编码序列的筛查成为必需。预筛选可以用来识别序列变异的存在。当下选用高分辨率溶解曲线分析法[15]。一旦一个序列变异被识别，其精确序列就可被桑格双脱氧测序法测出。桑格测序法的敏感度不及前面所述的方法，而且必须确保肿瘤组织未受到非肿瘤细胞的严重污染。显微切割使肿瘤细胞富集是必要的，或者可以使用新一代的测序技术，尤其是在很多样本需要筛检的时候。

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