遗传因素在后纵韧带骨化症发生机制中的作用

张颉鸿，刘 洋，袁 文

后纵韧带骨化症(ossification of the posterior longitudinal ligament，OPLL)是指脊柱后纵韧带发生异位骨化，骨化物压迫脊髓和神经根后出现神经功能损害症状的疾病。该病常见于颈椎，在亚洲中老年人群中高发，男性多见，可与其他脊柱退行性病变并存［1］。目前认为OPLL 是由多种因素共同引起，如遗传、代谢异常及机械应力刺激等。本文就OPLL遗传基因研究做一归纳，并阐述了在机械应力环境下易感基因对OPLL 发病的影响;此外，本文又简述了微RNA(microRNA，miRNA)在调节OPLL 易感基因成骨表达方面的研究进展，以便探讨遗传因素(OPLL 易感基因及miRNA)在OPLL 发生机制中的作用。

1 OPLL 主要易感基因

OPLL 发病带有明显的遗传倾向，且与多个基因相关。Matsunaga 等［2］对24 例颈椎OPLL 患者的家庭成员进行研究，发现带有较多人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)单倍体的家庭成员OPLL 发生率较高:若HLA 单倍体为双线性，OPLL发生率为53%(10/19);若为单线性单倍体，OPLL的发生率为24% (5/21);若无HLA 单倍体，OPLL发生率为4.8%(1/21)。排除一些目前尚有争议的基因，如核苷酸焦磷酸基因、维甲酸X 受体基因、维生素D 受体基因、瘦素受体基因等，现就目前研究认为与OPLL 相关性较大的基因作如下归纳。

1.1 COL11A2 基因

Maeda 等［3］研究发现，OPLL 患者COL11A2 基因的内含子6 的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)与正常人群有明显差异;还发现COL11A2 基因内含子6 的1 个SNP 在男女性之间有显著差异，该因素是否会造成OPLL 发病的性别差 异 有 待 进 一 步 研 究。Tanaka 等［4］也 发 现COL11A2 基因与OPLL 发病有较强的相关性。

1.2 骨形态发生蛋白-2 (bone morphogenetic protein-2，BMP-2)基因

Wang 等［5］研究发现BMP-2 基因中的Ser37Ala和Ser87SerSNP 与中国人OPLL 遗传易感及严重程度相关。他们发现Ser37Ala(T/G)SNP 与OPLL 的发生明显相关，与骨化范围和严重程度无关;Ser87Ser(A/G)SNP 与骨化范围和严重程度明显相关，而与OPLL 发生率无关。该研究证实，BMP-2 基因不仅与OPLL 发生有关，也与其进展和严重程度有关。其中，Ser37Ala(T/G)SNP 中的G 等位基因与OPLL 发生率相关;Ser87Ser(A/G)SNP 中的G 等位基因促进骨化进展，而A 等位基因限制骨化进展。

1.3 转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)基因

Kamiya 等［6］用等位基因特异性聚合酶链反应法对319 例没有亲属关系的日本人进行TGF-β1 基因分型研究，其中OPLL 患者46 例，对照组273 例，多元回归分析显示OPLL 患者该位点是C 等位基因的比例远高于对照组，表明TGF-β1 基因的T869 位点上C 等位基因是OPLL 遗传易感性的危险因素。Horikoshi 等［7］对711 例OPLL 患者和896 例对照组人群进行分析研究，对35 个候选基因共109 个SNPs 进行分析，结果发现3 个基因的5 个SNPs 与OPLL 相关，其中TGF-β3 基因的1 个内含子SNP(IVS1-1284G ＞C)与疾病最为密切相关。

1.4 COL6A1 基因

Kong 等［8］根据OPLL 发生相关的COL6A1 基因SNP 位点，对338 名汉族人(183 名患者和155 名对照者，183 名患者中包含OPLL 90 名、黄韧带骨化症(ossification of the ligamentum flavum，OLF)61 名、同时伴有OPLL 和OLF32 名进行分析，发现OPLL患者和OLF 患者COL6A1 基因的几个基因位点如:启动子(-572)、内含子32(-29)、内含子33(+20)SNP 改变单倍体的频率明显较对照组高，指出COL6A1 基因SNP 单倍体的出现与OPLL、OLF 的发生明显相关。提示COL6A1 基因可能是中国汉族人群OPLL 致病的易感基因。

1.5 Runx2 基因

Runx2 是间充质干细胞向成骨细胞分化的特异性转录调节因子［9］。Kishiya 等［10］为了解Runx2 与OPLL 关系，通过DNA 微阵列检测Runx2 基因表达，结果发现OPLL 患者Runx2 基因表达增强，OPLL 细胞培养后应用RNA 干扰技术抑制Runx 基因表达，发现成骨标志物(碱性磷酸酶、骨钙素等)和促血管生成素-1 表达明显下调，而正常细胞没有明显差异，提示Runx2 基因在脊柱韧带异位骨化发展过程中起重要作用。Liu 等［11］针对中国汉族人群进行了一项大样本SNP 研究，发现在OPLL 和OLF 患者中Runx2 基因的2 个位点RS1321075 和RS12333172的SNPs 与对照组有差异，其中一个位点的单倍体分型显示与OPLL 和OLF 的发生有关。提示Runx2基因可能是中国汉族人群OPLL 致病的易感基因。

综合近10 年OPLL 遗传学研究的进展，目前发现与OPLL 发生相关的基因主要有COL11A2，TGFβ，COL6A1，BMP-2，Runx2 等，以上基因均对骨代谢有着重要调节作用。相比之下，BMP-2 基因与OPLL 关系可能更为密切，它不仅与OPLL 的发生相关，还调控OPLL 骨化的继续进展，因此其对OPLL的发生、发展全过程可能都有调控作用，其中，Runx2 是BMP 成骨信号通路中的关键节点，在缺少Runx2 基因调节时，BMP-2 无法促使骨化［12］。然而，虽然有研究证明OPLL 患者中Runx2 基因存在变异［11］，但OPLL 发生与该基因突变直接相关的证据仍然不足，尚待进一步研究证实。

2 在机械应力环境下易感基因对OPLL 发生的影响

目前认为，OPLL 是一类在特定环境(如持续力学刺激作用下)罹患的遗传疾病，众多研究证实，机械应力刺激在脊柱韧带骨化的发生机制中起着重要作用［13］。生物力学的影响贯穿于整个韧带骨化过程中，骨化的进展程度与应力刺激条件的变化关系密切。Matsunaga 等［14］研究发现，颈椎的前屈、后伸、侧屈活动及髓核组织的突出直接导致患者颈椎间盘应力分布异常、后纵韧带张力增高，这种对于后纵韧带的机械刺激直接加速了OPLL 进程。Takatsu等［15］对97 例颈椎OPLL 术后患者进行放射学研究，结果发现，后路手术加速了OPLL 的进展，认为后路手术破坏了颈椎后方结构，导致颈椎不稳，后纵韧带张力增加，使骨化明显进展。Tsukamoto 等［16］通过反复牵拉刺激成年Wistar 大鼠的尾椎，2 周后发现韧带内BMP-2 明显表达，并有软骨形成，提示机械应力刺激在韧带骨化过程中起重要作用。

Runx2 是成骨细胞分化所必需的基因。研究证实Runx2 不仅调节成骨细胞的分化，还能通过促进骨细胞外基质蛋白的合成，如Ⅰ型胶原、骨钙素、纤维连接蛋白等，来调节成熟的成骨细胞成骨［17-18］。近年来，研究发现Runx2 基因能介导细胞外应力刺激，促使细胞向成骨方向分化，异位骨化也与之有关［19］。一项SNP 研究发现OPLL 患者中Runx2 基因存在变异［11］，认为Runx2 是OPLL 易感基因。Xue 等［20］建立创伤后异位骨化的家兔模型，再将人工合成的特异siRNA 注射入家兔创伤部位，来干扰Runx2 基因表达，10 周后观察发现，与对照组相比，干预组创伤部位骨化组织明显减少，作者认为通过抑制Runx2 基因来防治异位骨化是一种可行的方法。

大量研究发现Runx2 基因是机械应力刺激细胞成骨分化的重要靶点。Ziros 等［21］实验证实，力学刺激通过丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)通路，将力学信号转导入细胞内，增强细胞内Runx2 基因表达，提高Runx2 蛋白与下游基因DNA 的结合力，并使Runx2 蛋白磷酸化，能促使细胞向成骨方向分化成熟。而在模拟卧床及失重状态下的滚筒中及实际的失重状态下，细胞Runx2 基因表达和成骨分化均受抑制。Iwasaki等［22］、Tanno 等［23］将周期性拉力作用于来自OPLL患者和非OPLL 患者的脊柱韧带组织及其原代培养的细胞，发现拉力作用下的OPLL 患者韧带组织和细胞的Runx2 蛋白表达明显增强，且骨钙素、碱性磷酸酶等成骨标志物也表达增高，而无拉力作用的对照组表达无差异。同样，Cai 等［24］研究发现体外机械应力作用于OLF 患者来源的黄韧带原代细胞，24 h后发现Runx2 基因表达较对照组明显增高，OLF 患者黄韧带组织免疫组化结果也显示Runx2 蛋白分布多于对照组。以上研究结果充分证明了在力学刺激下，Runx2 基因会发生高表达，促进细胞成骨分化，因此推测Runx2 基因可能为OPLL 的易感基因，在受到外界易感因素机械应力持续影响后，被牵拉的后纵韧带细胞内Runx2 基因发生异常高表达，随之向成骨分化，最终导致韧带骨化发生，可认为是遗传和环境因素相互作用促使了OPLL 发生。这个猜想符合OPLL 多因素相互作用发生的临床特点，但目前证明Runx2 基因是OPLL 易感基因的证据仍不足，这个猜想尚需进一步研究证实。

3 miRNA 对OPLL 致病基因的潜在调控作用

miRNA 是新近发现的人体内一类调控性非编码小RNA，参与调控包括细胞增殖、分化和凋亡等一系列生理进程，在基因表达过程中起着重要的调节作用，其调节紊乱将导致疾病发生。其调控机制是通过结合mRNA 的3＇端非编码序列，降解靶基因mRNA 或转录后抑制靶基因表达而发挥作用［25］。已有研究证实，miRNA 在骨组织中的调控作用主要效应于成骨过程，且成骨调节可表现为促进或抑制成骨的双向作用，正常情况下两者处于平衡状态，若部分miRNA 表达异常，将促使成骨调节紊乱，正常细胞可能会发生骨化［26］。

在miRNA 表现为抑制成骨的研究中，miR-199a是第一个被发现的BMP-2 反应型miRNA，它可以通过调节BMP 信号通路的关键调节因子Smad1，来抑制早期软骨细胞的分化［27］。Li 等［26］通过对BMP-2诱导的间充质细胞骨形成过程中基因芯片的研究，发现有22 个miRNA 表达下调，其中miR-133 和miR-135 分别作用于Runx2 和Smad5 靶基因，故认为是通过阻碍了BMP-2 成骨信号转导从而抑制骨形成。此外，体外细胞研究发现，miR-204 能与Runx2 基因3＇端非编码序列特异性结合，内源性下调人骨髓多能干细胞中Runx2 表达，导致成骨分化过程受抑制［28］。

在miRNA 表现为促进成骨的研究中，Zhang等［29］发现在成骨培养基诱导下，miR-20a 通过上调BMP/Runx2 信号促进人骨髓间充质干细胞向成骨分化。研究显示miR-29b 能调控胶原基因促进合成Ⅰ型胶原，为成骨细胞分化成熟提供细胞外基质，同时又可通过抑制TGFβ3 蛋白的翻译来促进Runx2的表达，促进成骨细胞分化［30］;在另一研究中，利用基因芯片分析发现，成骨培养基环境下培养的人脊柱韧带细胞miRNA 表达与对照组有差异，并证实miR-29b 表达上调，认为其可能促进了脊柱韧带成纤维细胞向成骨细胞分化［31］，这说明脊柱韧带异位骨化发生与miRNA 对易感基因成骨表达的异常调节有关。

尽管近年来对OPLL 的认识不断加深，但其具体发生机制仍然不清。随着遗传学和基因检测手段的进步，越来越多的OPLL 易感基因被发现。由于OPLL 具有多因素共同致病的特点，在易感基因致病的基础上，必须考虑环境因素对易感基因的影响，如力学刺激，易感人群的后纵韧带长期接触这些环境易感因素，触发了后纵韧带细胞内易感基因的异常表达，这个过程为成骨信号进入细胞后，经过一连串的信号转导，最终使细胞向成骨方向异常分化，而在成骨信号转导过程中，某些小RNA 起着必不可少的调节作用，如miRNA，若部分miRNA 表达异常，也会使易感基因成骨表达异常增强，可促使OPLL发生。由于OPLL 被看作是一类在特定环境(如持续力学刺激作用下)罹患的遗传疾病，弄清楚易感基因和环境因素(如力学因素)在OPLL 发生过程中的关系，以及miRNA 在易感基因成骨异常表达中的潜在调控作用，可为将来从遗传学角度认识OPLL发生机制开辟道路，有助于更好地理解脊柱OPLL发生发展的自然史，为下一步研究和干预OPLL 发病奠定基础。

［1］刘洋，袁文.脊柱后纵韧带骨化性疾病的基础研究进展［J］.脊柱外科杂志，2010，8(2):120-123.

［2］Matsunaga S，Yamaguchi M，Hayashi K，et al.Genetic analysis of ossification of the posterior longitudinal ligament［J］.Spine(Phila Pa 1976)，1999，24(10):937-938.

［3］Maeda S，Ishidou Y，Koga H，et al.Functional impact of human collagen alpha2(XI)gene polymorphism in pathogenesis of ossification of the posterior longitudinal ligament of the spine［J］.J Bone Miner Res，2001，16(5):948-957.

［4］Tanaka T，Ikari K，Furushima K，et al.Genomewide linkage and linkage disequilibrium analyses identify COL6A1，on chromosome 21，as the locus for ossification of the posterior longitudinal ligament of the spine［J］.Am J Hum Genet，2003，73 (4):812-822.

［5］Wang H，Liu D，Yang Z，et al.Association of bone morphogenetic protein-2 gene polymorphisms with susceptibility to ossification of the posterior longitudinal ligament of the spine and its severity in Chinese patients［J］.Eur Spine J，2008，17(7):956-964.

［6］Kamiya M，Harada A，Mizuno M，et al.Association between a polymorphism of the transforming growth factor-beta1 gene and genetic susceptibility to ossification of the posterior longitudinal ligament in Japanese patients［J］.Spine (Phila Pa 1976)，2001，26(11):1264-1266.

［7］Horikoshi T，Maeda K，Kawaguchi Y，A large-scale genetic association study of ossification of the posterior longitudinal ligament of the spine.Hum Genet.2006 Jul;119(6):611-616.

［8］Kong Q，Ma X，Li F，COL6A1 polymorphisms associated with ossification of the ligamentum flavum and ossification of the posterior longitudinal ligament.Spine (Phila Pa 1976).2007 Dec 1;32(25):2834-2838.

［9］李彬，张柳.Runx2 与骨代谢的调控［J］.中国骨质疏松杂志，2009，15(1):63-67.

［10］Kishiya M，Sawada T，Kanemaru K，et al.A functional RNAi screen for Runx2-regulated genes associated with ectopic bone formation in human spinal ligaments［J］.J Pharmacol Sci，2008，106(3):404-414.

［11］Liu Y，Zhao Y，Chen Y，et al.Runx2 polymorphisms associated with OPLL and OLF in the Han population［J］.Clin Orthop Relat Res，2010，468(12):3333-3341.

［12］Yamaguchi A，Komori T，Suda T.Regulation of osteoblast differentiation mediated by bone morphogenetic proteins，hedgehogs，and Cbfa1［J］.Endocr Rev，2000，21(4):393-411.

［13］许鹏，何海龙，叶晓健.机械应力刺激在脊柱韧带骨化发生中的作用［J/CD］.中华临床医师杂志:电子版，2011，5(4):1075-1077.

［14］Matsunaga S，Sakou T，Taketomi E，et al.The natural course of myelopathy caused by ossification of the posterior longitudinal ligament in the cervical spine［J］.Clin Orthop Relat Res，1994(305):168-177.

［15］Takatsu T，Ishida Y，Suzuki K，Radiological study of cervical ossification of the posterior longitudinal ligament.J Spinal Disord.1999 Jun;12(3):271-273.

［16］Tsukamoto N，Maeda T，Miura H，et al.Repetitive tensile stress to rat caudal vertebrae inducing cartilage formation in the spinal ligaments:a possible role of mechanical stress in the development of ossification of the spinal ligaments［J］.J Neurosurg Spine，2006，5(3):234-242.

［17］Komori T.Regulation of skeletal development by the Runx family of transcription factors.J Cell Biochem.2005 Jun 1;95(3):445-453.

［18］Stein GS，Lian JB，van Wijnen AJ，Runx2 control of organization，assembly and activity of the regulatory machinery for skeletal gene expression.Oncogene.2004 May 24;23(24):4315-4329.

［19］董军，袁文，王新伟.颈椎后纵韧带骨化症病因的研究进展［J］.脊柱外科杂志，2008，6(1):51-54.

［20］Xue T，Mao Z，Lin L，et al.Non-virus-mediated transfer of siRNAs against Runx2 and Smad4 inhibit heterotopic ossification in rats［J］.Gene Ther，2010，17(3):370-379.

［21］Ziros PG，Gil AP，Georgakopoulos T，et al.The bone-specific transcriptional regulator Cbfa1 is a target of mechanical signals in osteoblastic cells［J］.J Biol Chem，2002，277(26):23934-23941.

［22］Iwasaki K，Furukawa KI，Tanno M，et al.Uni-axial cyclic stretch induces Cbfa1 expression in spinal ligament cells derived from patients with ossification of the posterior longitudinal ligament［J］.Calcif Tissue Int，2004，74(5):448-457.

［23］Tanno M，Furukawa KI，Ueyama K，et al.Uniaxial cyclic stretch induces osteogenic differentiation and synthesis of bone morphogenetic proteins of spinal ligament cells derived from patients with ossification of the posterior longitudinal ligaments［J］.Bone，2003，33(4):475-484.

［24］Cai HX，Yayama T，Uchida K，et al.Cyclic tensile strain facilitates the ossification of ligamentum flavum through β-catenin signaling pathway:in vitro analysis［J］.Spine (Phila Pa 1976)，2012，37(11):E639-646.

［25］He L，Hannon GJ.MicroRNAs:small RNAs with a big role in gene regulation［J］.Nat Rev Genet，2004，5(7):522-531.

［26］Li Z，Hassan MQ，Volinia S，et al.A microRNA signature for a BMP2-induced osteoblast lineage commitment program［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2008，105(37):13906-13911.

［27］Lin EA，Kong L，Bai XH，et al.miR-199a，a bone morphogenic protein 2-responsive MicroRNA，regulates chondrogenesis via direct targeting to Smad1［J］.J Biol Chem，2009，284(17):11326-11335.

［28］Huang J，Zhao L，Xing L，et al.MicroRNA-204 regulates Runx2 protein expression and mesenchymal progenitor cell differentiation［J］.Stem Cells，2010，28(2):357-364.

［29］Zhang JF，Fu WM，He ML，et al.MiRNA-20a promotes osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells by co-regulating BMP signaling［J］.RNA Biol，2011，8(5):829-838.

［30］Li Z，Hassan MQ，Jafferji M，et al.Biological functions of miR-29b contribute to positive regulation of osteoblast differentiation［J］.J Biol Chem，2009，284(23):15676-15684.

［31］张秀梅，崔亚洲，周小艳，等.MicroRNAs 参与韧带成纤维细胞成骨分化相关分子表达的调节［J］.中国生物化学与分子生物学报，2011，27(6):540-547.