骨髓血管微环境对造血干细胞“干性”的维持作用

刘 莉，涂怀军，彭 婷，喻松霞，贺 玲，李 剑*

(南昌大学第二附属医院1.血液病研究所;2.神经内科，江西南昌330006)

造血干细胞(hematopoietic stem cells，HSCs)微环境是指在造血组织中HSCs 定居以及进行自我更新并能产生大量造血祖细胞的特定场所。目前认为HSCs 微环境是由骨内膜微环境和血管微环境组成，骨内膜微环境可维持HSCs 处于静止状态及自我更新的能力，而血管微环境则促进HSCs 动员、增殖及分化。近年诸多实验证据颠覆了这一概念，血管微环境也可分泌生长因子、信号分子及功能蛋白调节HSCs 的自我更新和归巢，并与骨内膜微环境协同作用维持人体血液和免疫系统的平衡。

1 血管细胞在胚胎发育期对HSCs 发育的作用

在人胚胎发育期，血管系统在HSCs 的形成及扩增过程中就起着关键作用。血管内皮细胞(endothelial cells，ECs)和HSCs 在胚胎期均起源于共同的前体细胞即成血-血管细胞［1］，在妊娠期间骨髓腔未形成之前，HSCs 就具有自我更新和分化的能力，证明这期间支持HSCs 的造血微环境与骨髓基本无关。在胎盘中，HSCs 的生存及造血都依赖脉管系统，此时HSCs 存在于卵黄囊、主动脉-性腺-肾区与卵黄动脉附近［2］。胚胎期的造血微环境跟成人的造血微环境存在很大的差别，其调控HSCs 的机制也不同于成人，但HSCs 对血管细胞的依赖一直从胎儿期延续至成人。

2 血管微环境中各种细胞相互作用调控HSCs

血管微环境是由造血组织中的血窦ECs 及血管周围细胞组成的特定血管区域。血窦由一层薄而有孔的ECs 组成，其无支持细胞覆盖而与骨髓实质细胞直接接触。围绕血窦存在的是各种异质血管周围细胞，已确认可调控HSCs 的主要细胞类型有网状细胞、间充质干/祖细胞、巨核细胞，窦周其他类型细胞如脂肪细胞是否参与调控HSCs 将有待于深入的研究。ECs 在血管微环境中充当主轴，其在解剖位置和生物功能上都与血管周围基质细胞有着紧密联系。

在体内巨核细胞与骨髓ECs 之间直接接触是生成血小板的必需要素，巨核细胞可通过成纤维细胞生长因子-4(fibroblast growth factor-4，FGF-4)增强其黏附在血管微环境中的能力，并活化趋化因子基质细胞衍生因子-1(stromal-derived factor-1，SDF-1)促进其跨内皮迁移，并依赖促血小板生成素(thrombopoietin，TPO)促进血小板的生成［3］。巨核细胞还可分泌与骨相关的蛋白质如骨桥蛋白参与调控HSCs［4］，其与成骨细胞在体外共培养时，能促进成骨细胞的增殖［5］。可见巨核细胞、ECs 与成骨细胞三者之间相互作用调控HSCs。

网状细胞广泛分布在骨髓中，其包括两类:成纤维细胞和上皮样网状细胞。其中上皮样网状细胞能黏附HSCs 和祖细胞并支持造血岛的形成。血窦壁外膜网状细胞(CXCL12 abundant reticular，CAR)与ECs 是分泌CXCL12 的重要细胞来源。CXCL12/CXCR4 能促进ECs 的迁移而助于外周血管的形成，推测CAR 也可能通过CXCL12/CXCR4 招募ECs 助于血窦的重塑。由于短期内去除CAR 细胞会影响脂肪细胞和成骨细胞的生成，故CAR 被认为是脂肪-成骨前体细胞［6］。

骨髓血窦周围存在一类间充质干/祖细胞，其具备自我更新、增殖的能力，可分化为骨髓基质细胞。间充质干/祖细胞高表达CD146+且位于血窦内皮下，高表达的CD146+可用于区分骨髓基质细胞与其他细胞。骨髓CD146+细胞在体外培养时能分化成多个谱系细胞，包括成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞，而间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)也具备这种特性［7］。骨髓CD146+细胞被移植到老鼠皮下可形成细胞结构与内源性骨髓相似的异位造血骨髓组织，同样条件下移植入CD146－细胞则形成骨［8］，说明CD146+细胞在造血骨髓的形成中可能起重要作用。

CAR 和骨髓CD146+细胞都可分化为成骨细胞和脂肪细胞，那么它们之间还存在什么联系呢?有学者认为CAR 是存在于骨髓中具有组织特异性的周细胞［9］。而体外培养的CD146+细胞能表达周细胞标志物，如NG2、PDGFRβ 等，表明CD146+细胞与周细胞有着共同的特征。而脑组织中的周细胞具有MSCs 的功能，采用绿色荧光蛋白标志嵌合体大鼠脑缺血模型的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)，在大鼠体内可观测到位于脉管系统周围的BMSCs 具有与周细胞相同的特征，且在脑组织中血管生成素-1(angiopoietin-1，Ang-1)主要由周细胞分泌，细胞培养也证实SDF-1 表达于周细胞而非ECs［10］。故推测，网状细胞、骨髓CD146+细胞与周细胞三者可能都来源于MSCs，或三者是同类异质细胞。骨髓中CAR 或CD146+细胞可能有助于血窦的形成，它们在造血微环境中所扮演的角色可能与周细胞在血管中所扮演的类同，包括与ECs 的互动、血管屏障作用、血管重构作用及分泌促进血管新生的信号分子等。

3 血管微环境参与维持HSCs 的自我更新及增殖

为了测试ECs 是否调节HSCs 的自我更新［11］，通过筛选人体多种组织来源的ECs 与HSCs 在体外共培养，结果显示这些ECs 都支持HSCs 的体外扩增，且在大脑内皮细胞(human brain endothelial cells，HUBECs)中发现过表达的肝素结合生长多效因子(pleiotrophin，PTN)可促进HSCs 损伤后的再植，而后实验证明骨髓血管微环境中ECs 和CAR 分泌PTN 可维持HSCs 的自我更新及再生［12］。血管微环境中分泌的PTN 与SDF-1/ CXCR4 协同作用调节造血干/祖细胞(hematopoietic stem/progenitor cell，HSPS)定居在骨髓中，基于这个特性，将来可能在HSCs 的移植中利用抗-PTN 促进HSPS 的动员。

Ang-1/Tie-2 在维持HSCs 处于静止期和抑制HSCs 的凋亡中起着重要作用，在面临应激造血时可保护HSCs 不被耗竭。骨髓中除了成骨细胞外，CD146+细胞也能分泌Ang-1［13］。ECs 中Tie2 结合Ang-1 后，Tie2 磷酸化后激活P13K/Akt 信号通路，Akt 激活后通过招募mTOR 而上调内分泌性血管舒缩障碍因子，支持CD34－Flt3－KLS HSPCs 的扩展和长期造血干细胞(long term-Hematopoietic stem cell，LT-HSCs)的再植能力［14］。血窦ECs 还高表达血管生成素样蛋白3(angiopoietin-like protein 3，Angptl3)，在稳态环境中其可维持HSCs 的静止状态，而在HSCs 移植中其可提高HSCs 的再植能力［15］，Angptl3 能抑制转录因子Ikaros 的表达，Ikaros 过表达时会减少HSCs 的再增殖活性，但Angptl3 的自身受体还未知。

干细胞因子(stem cell factor，SCF)/C-kit4 可促进HSCs 的自我更新及增殖。通过采取来自水母的表达绿色荧光蛋白的基因交换小鼠中表达SCF 的基因［16］，结果发荧光的细胞是骨髓ECs 和血管周围细胞，且当SCF 从ECs 或血管周围细胞中去除则导致HSCs 耗竭，当ECs 和血管周围细胞中的SCF 都丢失，则导致HSCs 几乎完全消失，证明SCF 主要来源于ECs 和血管周围细胞，并运用基因重组小鼠分别证明了成骨细胞和表达巢蛋白的BMSCs 分泌的SCF不是HSCs 所必需的。

4 血管微环境可促进HSCs 的归巢、动员及分化

血管微环境中ECs、CAR 和CD146+细胞均能分泌SDF-1。SDF-1 通过激活HSCs 和ECs 的黏附分子如E-和P-选择素，及促进基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的分泌等机制来介导HSCs 跨内皮迁移和归巢［17］。推测血管微环境分泌的SDF-1 与骨内膜表面分泌的SDF-1 构成浓度差调控HSCs 的归巢或动员。在低氧条件下的缺血性肾脏中观察到SDF-1/CXCR4 联合CXCR7 可促进MSCs 的动员及旁分泌活动［18］，且CXCL12/CXCR7 可促进肿瘤细胞的增殖以及新生血管的形成［19］，而在造血微环境低氧条件下，SDF-1/CXCR7是否促进HSCs 的增殖以及血窦的形成呢?

c-Mpl/TPO 是巨核细胞分化和血小板生成的必需信号通路。当采用myb 和P300 基因突变而导致小鼠体内的巨核细胞和血小板数量增加［20］，发现HSCs 在循环中的增加量与血清TPO 下降水平一致，反映了TPO 调控巨核细胞的分化，而巨核细胞的分化又反过来调控循环中TPO 和HSCs 的水平，在受到损伤时这种反馈机制可保持HSCs 与血细胞之间的动态平衡，表明HSCs 会受到其分化后的子代细胞的调控。

5 总结

骨髓中血管微环境与骨内膜微环境在解剖位置上紧密联系，可通过多种信号分子和细胞因子相互作用共同调节HSCs 的自我更新和归巢，但在生物功能上哪个占主导作用呢?目前的研究偏向于血管微环境，但血管微环境中还存在哪些必要的分子机制?人体是否还存在未知的HSCs 微环境?虽然造血组织的血管结构有别于非造血组织，但依据骨髓CAR和CD146+细胞与周细胞的相似特性，是否可推测非造血组织中的血管ECs 与周细胞之间存在的信号通路也可能存在于造血组织内呢?对这些问题的深入研究定会进一步了解HSCs 自我更新与增殖的调控机制。

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