不同抗凝剂、不同保存温度和保存时间对降钙素原检测的影响

徐全中， 王伟佳， 阚丽娟， 严海忠， 幕月晶， 欧阳能量， 黄燕华， 张秀明

(中山大学附属中山医院检验医学中心，广东中山528403)

降钙素原(procalcitonin，PCT)是无激素活性的降钙素前肽物质，是由116个氨基酸组成的相对分子质量为13 000［1］的糖蛋白。在生理情况下，主要是由甲状腺滤泡细胞产生，其浓度通常＜0.1 ng/mL［2］。1993 年，Assicot 等［3］首先提出PCT可以作为细菌感染的标志物。严重感染患者的PCT显著升高，并与感染的严重程度及临床预后密切相关［4］。其在感染后2～4 h即可升高，8～24 h就可以升高到峰值，并且其半衰期较长(20～24 h)，近年来PCT在提示细菌感染及其感染程度、判断治疗效果、指导抗菌药物治疗等方面发挥了重要的作用。作为临床实验室，对PCT检测时选择何种抗凝剂、采血后多长时间进行检测仍然有效和如何有效的保存标本是我们关心的问题，我们对此进行了探讨。

材料和方法

一、材料

采血管采用BD公司的真空采血管。肝素锂管批号为1213622，抗凝剂为75 USP Units;乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)管批号为1146897，抗凝剂3.6 mg;分离胶管批号为1179948;普通干燥管批号为1167597。Roche Cobas e601电化学发光免疫分析仪及其配套试剂、校准品、质控品(试剂批号为162192;校准品批号为162192;质控品批号为低值16195300，高值16195400)和配套消耗品。

二、方法

1.Roche Cobas e601电化学发光免疫分析仪检测PCT的精密度验证 参考美国临床实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)的EP15-A2文件《用户对精密度和准确度性能的核实试验2批准指南》［5］，选用5个不同浓度的标本，每个标本每天重复测定4次，持续5 d。计算分析内不精密度为1.04%，总不精密度为1.21%。仪器完全满足临床检测需要。

2.血液标本的采集 疑似细菌感染的住院患者13例，其中男7例，女6例，平均年龄45岁。空腹抽取静脉血分别注入真空干燥管、分离胶管、肝素锂管和EDTA-K2管中。普通干燥管和分离胶管室温(20～25℃)放置30 min，待血液凝固后1 300×g离心10 min分离血清，肝素锂管和EDTA-K2管颠倒混匀后即刻1 300×g离心10 min分离血浆。分离的血清或血浆各分装若干份于EP管密封备用。

3.分析方法 (1)不同抗凝剂对PCT检测结果的影响分析:用Roche Cobas e601电化学发光免疫分析仪对13例分装于真空干燥管、分离胶管、肝素锂管和EDTA-K2管分离的患者血清或血浆分别在即刻、12、24和72 h进行测定;(2)不同保存温度和保存时间对PCT检测结果的影响分析:用前一步选出的最适采血管，采集9例疑似细菌感染的住院患者(其中男4例，女5例，平均年龄41岁)血清或血浆，分别置于4、－30和－70℃保存，即刻分离血清或血浆时测定1次，4℃保存的标本分别在12 h、24 h、72 h、7 d进行测定，－30和－70℃保存的标本分别在24 h、72 h、7 d进行测定(－70℃保存的标本在7 d进行检测之前反复冻融2次)。

三、统计学方法

结 果

一、血清和不同抗凝剂的血浆检测结果

比较13例标本不同采血管的即刻检测结果，差异均不超过15%。EDTA-K2是试剂盒推荐的抗凝剂，并且以EDTA-K2抗凝的血浆PCT在72 h内的降解速率最慢，以EDTA-K2抗凝血浆即刻检测平均浓度作为百分百标准参照，普通干燥管检测平均浓度为102.84%，有+2.84%的差异;分离胶管为111.47%，有+11.47%的差异，肝素锂管为97.24%，有－2.76%的差异。

二、血清和不同抗凝剂的血浆在不同放置时间的降解百分率

13例标本不同采血管分离的血清或血浆室温下放置，12 h时 EDTA-K2管平均降解了(2.61±0.56)%，比较其他采血管，其降解速率最慢。分离胶管平均每小时降解0.46%，降解最快。在24 h时，普通干燥管、分离胶管、肝素锂管、EDTA-K2管分别平均降解了(9.66±1.60)%、(11.01±1.62)%、(8.00±0.91)%、(3.86±0.76)%。放置72 h时，分离胶管平均降解率达到(41.25±1.68)%，仍为降解最快，而 EDTA-K2管则仅平均降解(15.77±1.65)%。见图1。

三、EDTA-K2抗凝血浆不同保存温度下不同保存时间检测结果

9例EDTA-K2抗凝标本即使存放于4℃，在7 d时与分离血浆即刻测定差异无统计学意义(P＞0.05);存放于－70℃，7 d叠加反复冻融2次对测定结果无明显影响。见表1。

讨 论

健康成人血中的PCT浓度很低，但在严重的全身感染时可以在2～4 h升高，并且很快就可以达到峰值。Müller等［6］通过对79例怀疑感染的住院儿童进行研究，发现在严重感染(细菌、寄生虫或真菌感染)并有全身表现时，血PCT含量明显升高，而病毒感染和局部细菌感染没有全身表现的患者血PCT含量水平仅轻度升高。另外，监测血PCT水平还有助于临床正确、合理使用抗菌药物［7］。由于其在鉴别系统感染和非感染性炎症，及其严重程度、抗菌药物治疗、预后等方面发挥的重要作用，使其成为临床常规检测项目。临床常用血清作为检测标本，而在急诊检验工作中，多数用血浆标本做检验，用血浆作为标本的优点在于可以立即离心，缩短血液分离时间［8］。不同的抗凝剂、不同的存放条件和不同的存放时间对检测结果是否有影响以及影响大小还不清楚。1997年Meisner等［9］曾对PCT检测的影响因素做过研究，但其对有些影响因素(抗凝剂种类、标本的保存温度和保存时限)的研究还是比较局限，国内可以作为一定的参考但未必适用，国内是怎样的情况鲜有报道，为此我们对该方面做了进一步的探讨。

在对普通干燥管、分离胶管、肝素锂管和EDTA-K2管的研究中，肝素锂管比EDTA-K2管偏低2.76%。曾有报道，肝素对标记免疫分析影响程度的高低因方法与检测项目不同而不同［10-11］。本试验使用电化学发光法进行检测，可能是由于肝素具有强酸性并带有负电荷，会影响化学反应的催化环境、缓冲体系甚至是化学反应本身，使其检测结果偏低。普通干燥管和分离胶管测定结果比 EDTA-K2抗凝管结果分别偏高 2.84%、11.47%，至于造成这种差异的具体原因不明，还有待进一步探讨。用普通干燥管、分离胶管、肝素锂管、EDTA-K2管处理的血液标本，分离后室温存放，在12、24和72 h测定均是EDTA-K2抗凝血标本降解速率最慢，前12 h平均每小时降解速率不足0.22%，即使存放 72 h也才降解(15.77±1.65)%，平均每小时降解速率与前12 h每小时降解速率基本一致。EDTA-K2抗凝血标本存放于4、－30和－70℃条件下，在7 d内基本无降解，甚至在－70℃条件下保存即使反复冻融2次对检测结果的影响也很有限。

为保证检测结果的准确、及时、有效，可以从提高检验人员的业务水平、改进工作流程、缩短检测时间等方面来减少标本放置时间过长带来的影响。血浆中的PCT非常稳定，实验室可用常规的方法进行收集，无需特殊的储存条件。作为电化学发光法检测，本研究证实采用EDTA-K2作为抗凝剂采集标本不但缩短了标本检测，而且检测结果良好，并且长时间保存只具有很小的降解速率。但为了保证结果的准确，各个实验室应使用其各自方法推荐的抗凝剂在推荐的时间内进行检测。

［1］Snider RH Jr，Nylen ES，Becker KL.Procalcitonin and its component peptides in systemic inflammation:immunochemical characterization［J］.J Investig Med，1997，45(9):552-560.

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［3］Assicot M，Gendrel D，Carsin H，etal.High serum procalcitonin concentrations in patients with sepsis and infection［J］.Lancet，1993，341(8844):515-518.

［4］Phua J，Koay ES，Lee KH .Lactate，procalcitonin，and amino-terminal pro-B-type natriuretic peptide versus cytokine measurements and clinical severity scores for prognostication in septic shock［J］.Shock，2008，29(3):328-333.

［5］Clinical and Laboratory Standards Institute.User demonstration of performance for precision and accuracy［S］.EP15-A2，CLSI，2004.

［6］Müller B，Harbarth S ，Stolz D，etal.Diagnostic and prognostic accuracy of clinical and laboratory parameters in community-acquired pneumonia［J］.BMC Infect Dis，2007，7:10.

［7］Bouadma L，Luyt CE，Tubach F，etal.Use of procalcitonin to reduce patients' exposure to antibiotics in intensive care units(PRORATA trial):a multicentre randomised controlled trial［J］.Lancet，2010，375(9713):463-474.

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［9］Meisner M，Tschaikowsky K，Schnabel S，etal.Procalcitonin-influence of temperature， storage，anticoagulation and arterial or venous asservation of blood samples on procalcitonin concentrations［J］.Eur J Clin Chem Clin Bio Chem，1997，35(8):597-601.

［10］Hutchesson AC，Hughes SV，Bowden SJ，etal.In vitro stability of endogenous parathyroid hormonerelated protein in the blood and plasma［J］.Ann Clin Biochem，1994，31(Pt 1):35-39.

［11］陈望荣，杨绿舜，郑定容.CK-MB在肝素钠管与普通干燥管中的检测的比较［J］.实用医技杂志，2008，15(11):1415-1416.