沙门氏菌快速检测技术研究进展

章伟帆

（泉州市产品质量检验所，福建 泉州 362000）

沙门氏菌是一类革兰氏阴性菌，其广泛分布于自然界，是常见的人畜共患型致病菌。沙门氏菌对外界的抵抗力较强，耐胆盐，对营养需求不高。目前，已知沙门氏菌就将近2213种，而且几乎所有的沙门氏菌都能引起严重的食物中毒事件，是导致食物中毒的主要病原菌，对人类健康安全造成重大威胁。在美国，每年有650万～3300万人发生食物中毒，近5000人因此而丧生［1］。为此，美国政府每年需要花费近50亿～60亿美元［2］。在中国，沙门氏菌同样严重危害着我国的食品安全。据相关数据表明，我国每年因沙门氏菌而导致的食物中毒事件占所有食物中毒事件的40%～60%。所以，建立一种快速有效的检测手段是减少食物中毒事件的重要手段。但是由于沙门氏菌的血清型过于繁多，传统的检测方法又需要经过预增菌、选择性曾菌、分离培养、生化鉴定及血清学分型鉴定5个步骤。繁杂的生化反应使得检测过程十分复杂，耗时耗力，至少需要4～7天才能得到精确的检测结果。因此，寻找一种快速、有效、准确、简便的检测技术成为国内外学者研究的方向。下面就近年来对于沙门氏菌新的检测技术做一个简单的介绍。

1 免疫学检测方法

在所有检测食品中的沙门氏菌的技术手段中，免疫学检测技术占有重要的地位，主要是因为其价格低廉，不需要特定的实验仪器，容易在基层推广开来。其基本原理就是利用抗原抗体之间的特异性结合而到达检测目的。

1.1 酶联免疫吸附试验 （ELISA）

酶联免疫吸附试验 （ELISA）的基本原理是将抗原或者抗体先固定在某种固相载体上，然后加入酶标抗原或者抗体和受检样品，与固相载体上的抗原或者抗体发生特异性结合，从而形成抗原抗体复合物。将固相载体上多余的反应液清除后，加入酶反应底物，使得反应底物被固相载体上的酶所催化，产生有色物质，最后通过测量有色物质的含量来分析样品中待测物质的含量［3］。

1977年，Krysinski和Heimsch利用沙门氏菌鞭毛抗体，首次将ELISA方法应用于食品检测［4］。最初ELISA方法虽然能在48h内快速检测出沙门氏菌，但是由于所使用的多价抗血清在不同程度上存在交叉反应，使得最初用ELISA检测方法所得到的检测结果假阳性很高，而且灵敏度为105cfu/mL。随着单克隆抗体技术的产生，Robinson等［5］建立了直接ELISA检测方法，该检测方法大大降低了因交叉反应而出现的假阳性现象，显示出单抗的卓越性能。在我国，焦新安等［6］利用单抗技术获取了具有沙门氏菌广谱结合特性的4种单克隆抗体，其中2种反应互补，对已检沙门氏菌的覆盖率高达99%，而且并没有与受检大肠杆菌发生交叉反应；黎兆滚等［7］利用ELISA技术检测94份鱼粉样品中的沙门氏菌，所得的结果中阴性符合率为100%，阳性符合率为92%，总符合率为98%；另外，文其乙等［8］利用沙门氏菌特异性单抗de7和CB8形成了快速检测试剂盒，对500份蛋品进行ELISA检测，检测结果可靠，阳性率比国际标准方法高。

1.2 免疫磁珠分离技术 （IMS）

免疫磁珠分离技术法 （IMS）技术的原理是将特异性抗体偶联在磁性颗粒表面，在外加磁场的作用下与受检样品中的靶细胞特异性结合，使得靶细胞能够富集、分离。近年来，研究人员利用免疫磁珠来富集沙门氏菌，从而使得检测更加快捷。1996年，Mansfield和Forsythe比较了选择性培养基富集法和免疫磁珠捕捉法富集对120种食物进行沙门氏菌的富集和分离。结果表明免疫磁珠捕捉法富集效果和选择性培养基富集的效果相同［9］。IMS检测技术虽然在特异性方面具有很大的优势，但是灵敏度不足，所以近年来IMS技术都是与ELISA、PCR、Taqman PCR技术相结合，形成IMSELISA、IMS－PCR、IMS－TaqmanPCR技术，这样就大幅度的增加了检测的灵敏度，提高检测的准确率。

Kofitsyo等［10］利用免疫磁珠富集分离技术与酶联免疫吸附试验相结合，即IMS－ELISA技术检测食品中的沙门氏菌，包括前期的样品处理，整个检测过程只花费了26h，检测最低限为105cfu/mL；2008年Virve等利用免疫磁珠富集分离技术与荧光定量PCR相结合，即IMS－Taqman PCR技术，对食品中的沙门氏菌进行检测，包括样品处理的6h，整个流程只需要8h，而且灵敏度、准确度、特异性分别为98.4%、99.1%、100.0%［11］；2009年，Mercanoglu等［12］利用免疫磁珠富集分离技术与PCR技术有效的结合，建立快速有效检测沙门氏菌的IMS－PCR方法，对牛奶中的沙门氏菌进行检测只需要14h，而且检测的灵敏度达到1～10cfu/mL。

2 分子生物学技术检测

分子生物学检测方法是近年来发展最为迅速的食品检测手段之一，由于其具有简便快捷，特异性强，准确性高等优点，使得它在食品安全检测上表现出很大的优越性。

2.1 聚合酶链式反应技术 （PCR技术）

聚合酶链式反应技术 （PCR）是近年来发展较快的一项检测技术，它具有简便，快捷，特异性强以及灵敏度高等特点，现已广泛应用于食品安全检测。PCR技术检测沙门氏菌的基本原理很简单，就是通过设计特异性引物，扩增沙门氏菌中保守性高的核酸序列，根据实验结果分析受检样品中是否含有沙门氏菌，所以PCR技术的关键在于靶序列的选择和引物的设计。

近年来对于PCR检测技术的报道很多。invA基因是决定沙门氏菌的侵染力的，所编码的蛋白普遍存在于沙门氏菌表面，其序列具有高度的保守性［13］。Rahn等［14］利用沙门氏菌的invA基因作为靶序列，对630种沙门氏菌和142种非沙门氏菌进行检测，结果表明在非沙门氏菌中没有一个菌种扩增出目的条带，在630种沙门氏菌中除了4个菌种外，其余菌种均扩增出目的条带；在欧洲，由4个欧洲实验室联合对435个天然样品进行检测，结果表明用invA基因作为靶序列进行检测的特异性和准确性高达97.5%［15］。

在国内，我国研究人员也报道了许多有关该技术的文章。黄金林等［16］开发设计了沙门氏菌中高度保守的组氨酸转运操纵子基因序列的引物，并对15株沙门氏菌标准菌株，10株非沙门氏菌菌株以及27株现场分离的沙门氏菌菌株进行PCR扩增，结果表明所有对照菌株均未出现目的条带，而沙门氏菌菌株皆有495bp的目的条带，从结果可以说明所开发的这对引物对沙门氏菌的检测表现出极高的特异性；孔繁德等［17］根据沙门氏菌基因组序列中高度保守的序列fimY基因，建立了用于检测沙门氏菌的PCR通用方法，并用该方法对厦门地区的禽类产品进行了沙门氏菌的检测，取得了喜人的成绩；汪琦等［18］利用PCR方法快速检测方法对全脂奶粉、生牛肉和加工过的鸡肉中的沙门氏菌进行检测，其检测结果与传统检测手段检测结果一致，检出限为100cfu/25g，准确性达100%。

2.2 荧光定量PCR

荧光定量PCR不同于常规PCR之处在于，它能够对DNA进行定量检测，而且敏感性达到4.5 cuf/mL，是常规PCR的100倍，特异性高，能够避免PCR污染问题。其原理是在PCR过程中加入一个含有荧光基团标记的特异性寡核苷酸链探针，该探针两端分别标记有荧光淬灭基团和荧光报告基团。在PCR过程中，荧光淬灭基团从探针上脱落，从而使得荧光报告基团发出的荧光能够被荧光系统检测到。根据检测到的荧光信号对PCR过程进行实时监测，通过标准曲线对样品进行定量分析检测。

Seo等［19］在对鸡蛋的检测中，采用荧光定量PCR手段对D型沙门氏菌特有的sefA基因进行扩增，结果表明使用荧光定量PCR手段与常规检测方法检测的结果一致，而且最低检出限仅为1cfu/600g鸡蛋清洗液；Malorny等［20］在对鸡蛋和禽肉样品的冲洗液进行检测中，用Taqman探针扩增肠道沙门氏菌所特有的Prot6e基因，发现结果与常规检测100%一致，且最低检出限为3cfu/50mL；我国科研人员钟伟军［21］等根据stn基因设计了1对特异性引物和荧光探针，stn是能够编码鼠伤寒沙门氏菌肠毒素的基因，他们通过摸索荧光定量PCR体系和条件，建立了一套检验沙门氏菌的荧光定量PCR方法。他们利用这套方法对人工污染沙门氏菌的鸡蛋 （沙门氏菌初始含菌量为1cfu/g）和猪肉 （沙门氏菌初始含菌量为1cfu/g）进行检测，结果皆为阳性，具有较强的特异性和高的敏感性。

2.3 环介导等温扩增 （LAMP）

环介导等温扩增技术是由 Notomi等［22］在2000年开发的一种新的核酸扩增技术。它的原理是根据靶序列上的6个特定区域设计4条引物，在65℃恒温条件下，利用具有链置换活性的Bst DNA聚合酶能够在1h内扩增出109个靶序列拷贝的核酸扩增技术。在扩增过程中，反应液中的镁离子能够与从核苷酸中析出的焦磷酸根离子结合，生成肉眼可见的白色沉淀——焦磷酸镁。LAMP与常规PCR相比，其无需繁杂的电泳和紫外观察过程，也不需要昂贵的PCR仪器，所以便于基层应用。

LAMP技术的关键在于关键区域的选择和特异性引物的设计。研究发现invA基因在不同沙门氏菌菌株之间存在较高的同源性，而且通过Blast分析，该基因与其他物种并无同源关系，所以invA基因是沙门氏菌的一个重要的特殊区域。黄金海等［23］通过对invA基因进行引物设计，通过LAMP技术对4种非沙门氏菌和7种沙门氏菌血清型进行检测，结果发现7种沙门氏菌皆能进行有效扩增，而4种对照菌不能扩增，这说明利用invA基因设计出的特异性引物对于检测沙门氏菌具有极好的特异性。而且在对于食品中沙门氏菌的检测中，样品中最低检限为336cfu/mL，具有很高的灵敏性。

LAMP具有特异性强，灵敏性高，操作简便，无需仪器等优点。重要的是运用LAMP技术检测沙门氏菌只需要2h，即使加上增菌时间，也只需15h，便于基层的推广，具有很高的实用价值。

2.4 基因芯片 （DNA chip）

基因芯片又称生物芯片、DNA芯片。其原理是将许多已知的DNA探针固定在玻片或者硅片上，微生物样品DNA可以通过PCR的方法标记探针。然后将经过荧光标记的样品分子与固定在基因芯片上的DNA探针进行杂交。用洗脱液将没有杂交的样品分子洗脱后，通过荧光信号的强弱来判断样品分子的序列信息和数量，最后利用序列信息来分析样品中是否含有目的菌。该方法可以一次性检测多种病原菌，而且具有特异性强，灵敏度高，快速准确等特点，在检测沙门氏菌等致病菌中具有广泛的应用前景。

Cremonesi等［24］利用细菌的16SrRNA基因设计探针，制成基因芯片，成功运用于微生物中病原菌的检测；2006年，为了确认和验证鼠伤寒沙门氏菌的致病基因，Shannon等［25］利用基因芯片，通过PCR扩增了10个目的基因，并制成荧光探针标记与DNA杂交，这些基因包括：orgA、spi4H、purR、ORF319、rmbA、misL、spi4F、spi4N、rRNA以及ttrB，最终成功的检测到了71个致病基因，这个结果表明通过PCR扩增增加了基因芯片杂交的准确度和可信度；Wilson等［26］利用病原体致病基因和20寡核苷酸藻红素标记探针，开发了一套可以精确识别18种真核生物、原核生物和致病性病毒的DNA微阵列。

3 检测沙门氏菌的其他方法

除了上述所介绍的免疫学方法和分子生物学方法，近年来其他越来越多的新技术也体现出它的优越性。

3.1 生物传感器 （Biosensor）

生物传感器的原理是将待测样品与仪器中的生物分子识别原件发生反应，然后通过仪器中特有的信号转换器将反应信号转变成可辨别的光信号或者电信号。所以，影响生物传感器检测的特异性和灵敏性的关键在于仪器中的生物分子识别原件以及信号转换器。Pathiran等［27］使用沙门氏菌的多克隆抗体制成生物分子识别原件，制成可用于检测沙门氏菌的生物传感器，该传感器反应时间小于100s，最低敏感度为102个细胞/mL。虽然生物传感器具有自动化程度高，分析速度快，对使用者要求低等特点，但由于生物分子识别原件寿命短，生产成本高，这是阻碍该方法发展的重要原因。

3.2 热裂解气相色谱－质谱技术 （Py－GC－MS）

热裂解气相色谱—质谱技术是一种简单、快速、灵敏度高的一种新技术，目前已经广泛应用于微生物的鉴定和检验当中。郭爱玲等［28］采用Py－GC－MS技术对沙门氏菌细胞进行检测，通过分析总离子流色谱图，确定沙门氏菌热裂解气相色谱－质谱的条件与部分裂解产物的结构，从而能够为快速鉴定沙门氏菌提供新的方法；董海燕［29］建立了一套Py－GC－MS快速检测沙门氏菌的方法，她将4种沙门氏菌全细胞在650℃下裂解，时间为12s，离子源温度230℃的条件下，得到了4张总离子色谱图，确定了4种沙门氏菌裂解产物 （吲哚、苯酚、1－十三烯）的分子结构，为快速检测沙门氏菌奠定了基础。

3.3 电阻抗法

近年来一项新的生物技术——电阻抗法已经逐步应用于食品中微生物的检测，而且对食品中沙门氏菌的检测已经通过了AOAO的认可。其原理是根据不同微生物在生长和繁殖过程中，将培养基内电惰性大分子底物分解成电活性小分子产物的能力不同，从而导致电阻抗降低的程度不同。Pless等［30］用电阻抗法和传统检测方法对250种食品中进行沙门氏菌检测，结果表明在122种沙门氏菌污染食品中，电阻抗法检出了119种，而传统检测方法仅检出了106种；陈广全等［31］对21种人工加入沙门氏菌的食品进行检测，分别用了电阻抗法和传统检测方法，结果电阻抗法检测结果与传统检测结果一致，对于阴性结果可以在48h内得到。这说明电阻抗法能够快速、准确地检测出食品中的沙门氏菌。

4 小结

随着生物学技术的发展，新的食品检测技术层出不穷。这些技术与传统检测方法相比较而言，具有快速、简便、特异性强等特点。分子生物学检测手段虽然能够快捷地检测沙门氏菌，但是技术难度大，成本高，推广难度大。而免疫学方法中ELISA应用较为普遍，随着相关研究的不断深入，ELISA技术在食品检测中发挥着越来越重要的作用。总之，随着免疫学和分子生物学的发展，相信对于食品中沙门氏菌的检测技术将向着快捷、特异性强、灵敏度高、经济实惠的方法不断发展。

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