水溶性甘草多糖的分离纯化、结构及生物活性研究进展

代巧玉，康 丁，张洪斌

上海交通大学化学化工学院，上海 200240

甘草是一种古老而应用广泛的中草药，它在包括中国、日本、英国等国家的药典中均有记载，甘草还作为添加剂广泛应用于食品行业［1］。甘草属植物的科学研究始于20世纪60年代，目前已从甘草物种中提取出超过400种化合物。甘草具有抗溃疡［2］、抗炎［3］、抗痉挛［4，5］、抗氧化［6］、抗过敏［7］、抗病毒［8］、抗癌［9］、抗抑郁［10］、抗血管增生［11］、保护肝脏［12］以及加强记忆力［13］等药理学活性，其中三萜皂苷和黄酮类化合物被认为是其中的活性成分［14］。甘草中还存在一类重要的活性大分子成分——甘草多糖，研究表明，甘草的免疫调节、吞噬作用、抗补体作用、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化等性质都与甘草多糖有关［15，16］。甘草小分子活性物质的相关报道较多，本文则着重综述水溶性甘草多糖大分子的分离提取和纯化、结构解析以及药理活性研究的最新进展。

1 水溶性甘草多糖的分离提取与纯化

目前文献中涉及的水溶性甘草多糖的提取方法包括水煎煮法［17，18］、超声法［19，20］、酶法［21］和微波辅助法［22，23］。相对于水煎煮法，超声法可提高提取率，酶法则可在较温和的条件下进行，且酶具有高度特异性，不会对中药中的有效成分造成破坏。微波辅助法也可在较低的温度下完成萃取过程，能够有效保护提取成分的质量。

采用上述方法获得的甘草多糖只是粗多糖，还需进行去蛋白、去除小分子等纯化过程。最后将多糖进行分级来获得均一的组分［24-26］。蛋白质的去除方法通常有Sevag法、三氯乙酸法、三氟三氯乙烷法、酶法、盐酸法和鞣酸法。这些方法可以单独使用，也可以两种或多种方法结合使用。甘草多糖的纯化方法主要有分级沉淀［27］、季铵盐沉淀法［28，29］、凝胶柱层析和离子交换色谱法［25，30］等。

2 水溶性甘草多糖的结构分析

多糖结构的详细表征通常较困难，这是由于构成多糖结构单元的单糖的种类多，连接位点和糖苷键类型多样，多糖还常常具有复杂的链分支结构。目前对甘草多糖的结构分析尚限于一级结构的解析，主要涉及结构单元信息和基本的糖苷键连接方式，而对其高级结构知之甚少。

关于组成单元，有报道认为甘草多糖为α-(1→4)-D-葡聚糖［24，25］，但更多的研究表明其为杂多糖［31-36］。Tomoda等［31-33］对甘草中提取的 3 种水溶性多糖UA、UB和UC进行分析认为，3种水溶性多糖所含单糖种类和组成比各异，按L-树胶醛糖∶D-半乳糖∶D-葡萄糖∶L-鼠李糖∶D-半乳糖醛酸组成比顺序，UA 为22∶14∶0∶1∶3，而 UB 为12∶10∶1∶10∶20，UC为10∶30∶27∶1∶0。还有报道认为甘草多糖由葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖和半乳糖组成，以葡萄糖为主［34］。近期则有报道认为甘草多糖含有鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖和葡萄糖，不含甘露糖［35］，以及主要由α-D-葡萄糖、α-L-阿拉伯糖和 α-D-半乳糖组成，摩尔组成比为 8.0∶1.8∶1.0［36］。

关于链结构，Tomoda等［31-33］认为UA主体结构是以β-1，3连接的D-半乳糖为主链，在半乳糖单元的六位上都有以 α-1，5-阿拉伯糖-β-1，6 或者 1，3 连接的半乳糖残基为主的侧链;UB结构上与UA类似，但是其主体结构是支化的鼠李糖半乳糖醛酸聚糖，而UC是一种阿拉伯糖-3，6-半乳葡聚糖型的多糖。Tomoda等［29，37］还从光果甘草的匍匐茎中分离出一种酸性多糖(GA)，认为其结构特征主要包括α-阿拉伯糖-β-3，6-半乳糖型的结构单元，GA 的主体结构具有一个β-1，3连接的D-半乳糖残基的主链，主链中3/5的半乳糖单元在6号碳上连接一个由β-1，3和β-1，6连接的半乳糖基残基组成的侧链。孙润广等［38］借助原子力显微镜分析认为甘草多糖具有螺旋结构，有至少3种主要的核心结构，一是以葡萄糖为主链，通过α-(1，4)键连接的单一葡萄糖结构，二是以1，3-D-半乳糖组成的主链，在主链半乳糖某单元的6位上带有由1，6-半乳糖残基组成的侧链分支，以及以1，3-D-半乳糖组成主链，在主链所有半乳糖单元的6位带有由α-1，5-连接的L-阿拉伯糖残基组成的侧链。

由上述可见，依据现有文献报道，甘草中水溶性多糖有多种，一般为结构复杂的支化杂多糖。尽管主链结构可能单一，但现有研究并不能排除主链为杂多糖链的可能性，也不能提供侧链取代位置、分布和长短的完整信息。

3 水溶性甘草多糖的生物活性

作为传统中药材，一直以来，甘草的药理作用是研究重点。甘草主要用于治疗消化性溃疡、丙型肝炎、肺部和皮肤疾病。临床和实验还证明甘草具有抗炎、抗病毒、抗菌、抗氧化、抗癌、免疫调节和保肝等药理作用［39］。甘草中最主要的药理活性成分是甘草皂苷(主要包括甘草酸和糖苷配基甘草次酸)和黄酮类化合物。但是越来越多的研究证明，多糖具有复杂的多方面的生理活性和功能，特别是对于机体免疫功能的作用。甘草中的多糖也受到了越来越多的关注。甘草多糖已被发现具有抗肿瘤、抗炎、抗病毒、免疫调节、抗氧化、抗粘附等生理活性［40，41］。

3.1 水溶性甘草多糖的免疫调节活性

甘草多糖对机体的免疫调节作用主要是激活机体的免疫系统，具体表现为促进淋巴细胞、巨噬细胞等免疫细胞的成熟、分化和繁殖，诱导巨噬细胞产生NO，提高机体血清中的抗体水平，活化网状内皮系统和补体［29，30，40］。

甘草多糖对机体免疫调节作用的研究一般要通过动物试验方法来进行，通过测定免疫系统中具有免疫活性的某种因子的含量指标或者起免疫作用的细胞的活性来测定。Tomoda等［29，31］选取雄性小鼠为试验对象，将提取纯化的甘草多糖用于碳廓清实验。结果表明，甘草多糖具有强化网状内皮系统的活性。Hong等［40］选取昆明系小鼠为试验对象，研究了通过水提醇沉方法获得的水溶性甘草多糖对高脂饮食小鼠的脾淋巴细胞的增殖和血清中抗体水平的影响。结果发现，与对照组相比，喂食了甘草多糖的试验组高脂饮食小鼠的脾淋巴细胞增值指数显著增加，血清中各种抗体的水平也明显提高。Cheng等［30，42］研究了甘草多糖对巨噬细胞活性的影响，发现甘草多糖能够增强巨噬细胞的胞饮活性并诱导细胞产生更多的NO和超氧阴离子()，从而增加巨噬细胞的免疫功能，甘草多糖还能够促进酸性磷酸酶、腺苷三磷酸酶、酸性非特异性酯酶和琥珀酸脱氢酶的产生，同时也诱导了溶解酵素和超氧化物歧化酶的活性。He等［43］通过研究甘草多糖对于患有癌症的小鼠体内的调节性T细胞和Th1/Th2类细胞因子的影响，发现甘草多糖能够降低调节性T细胞的比例，降低Foxp3在调节性T细胞中的表达，提高小鼠血清中Th1/Th2类细胞因子比例，从而可能部分抑制肿瘤的生长。Li等［44］发现甘草多糖能够诱导小鼠骨髓树突状细胞的成熟。

甘草多糖的免疫调节作用虽然不能直接作用于肿瘤细胞，但是通过激活机体的免疫系统，促进淋巴细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞的成熟、分化和繁殖，同时活化网上内皮系统和补体，促进各种细胞因子的生成，从而起到一定的抗肿瘤作用［45］。王岳五等［46］研究表明，甘草多糖作为生物效应调节剂，可以影响机体的免疫功能，从而起到抗病毒的作用。他们研究了水溶性甘草多糖对牛艾滋病病毒(BIV)、腺病毒Ⅲ(AdVⅢ)和柯萨奇病毒(CBV3)的抑制作用，发现甘草多糖对3种病毒均有较为明显的拮抗作用。

3.2 水溶性甘草多糖的抗氧化活性

许多发生在人体内的生理学和生化过程中都可能产生以氧为中心的自由基和其他活性氧。过多的自由基会对人体内的生物大分子(如脂肪、蛋白质、DNA)造成氧化性损伤，最终导致一些慢性疾病(如动脉粥样硬化、癌症、糖尿病和其他退行性疾病)的发生［47］。甘草中的黄酮类化合物已被证实具有一定的抗氧化活性［48］，一些研究同样表明甘草多糖也具有抗氧化活性。甘草多糖的抗氧化活性主要通过两方面来体现，一是通过增强体内抗氧化酶的活性来减小氧化应激，二是甘草多糖对自由基的清除作用［40］。还有研究表明，甘草多糖溶液对DPPH自由基、羟自由基和超氧阴离子自由基具有较好的清除作用［49-50］。

随着对甘草多糖研究的不断深入，甘草多糖除了上述的活性外，还被证实有其他的的活性。如Tomoda等［33］从甘草多糖中分离出一种含阿拉伯糖-3，6-半乳聚糖型的酸性多糖，发现它具有抗补体活性、碱性磷酸酶诱导活性和增强网状内皮系统活性。Wittschier等［51］发现1 mg/mL的甘草提取液即能够有效地抑制幽门螺杆菌对人体胃粘膜的粘附，而这一性质与提取液中的多糖成分相关，其中纯化后的一种酸性多糖组分是主要的活性成分。此外，还有报道甘草粗多糖对牙龈卟啉单胞菌具有强烈的抗粘附作用［52］，对小鼠急性肝损伤具有保护作用［53］。

4 结束语

尽管甘草使用历史悠久、应用广泛，其中小分子活性物质的研究取得了一定进展，甘草多糖本身的生物活性得到了一定揭示，但相比其它多糖，甘草多糖的基础研究和应用开发均显得严重不足，目前的研究状况仍处于初级阶段。甘草中的多糖种类多、结构复杂，要得到均一的组分、获得明晰的结构特点都具有很大挑战性。在分离提纯、结构分析和生物活性研究上要有别于小分子，体现大分子的研究特征。目前对甘草多糖的研究还限于水溶性的，对于其结构分析的报道主要还集中于单糖单元的类别、组成比例以及糖苷键的连接方式上。即使在这些方面，完整准确的化学结构信息还远不完备。作为多糖大分子常常体现出的、与其物理化学性质和生物活性密切相关的高级结构以及构象和构象变化、可能的聚集体形态等也鲜有报道。甚至对于大分子而言，一些重要的基本分子结构参数如分子量及分子量分布、取代度及取代度分布、分子尺寸等研究亦未见开展。重要的如溶液性质、分子间相互作用、与蛋白质的连接方式，以及其本身的功能化和改性等研究尚属空白。化学结构以及高级结构的不明晰也从根本上影响了对于甘草多糖的药理和生物活性的认知，这也直接导致甘草多糖构效关系不明晰。此外，高效的工业化分离纯化制备技术尚缺乏，这也影响了甘草多糖应用的进一步开发。

上述一直阻碍甘草多糖结构-功能关系研究深入发展的瓶颈问题亟待克服。现有研究表明，水溶性甘草多糖是成分多种、分子结构高度支化、连接有蛋白质成分的杂多糖。与之类似的植物多糖阿拉伯胶和果胶等或可在分离纯化、结构表征和生物活性研究方面提供有益借鉴。水溶性甘草多糖已被揭示出具有多方面的生物活性，详细的结构解析和构象分析成为进一步阐明构效关系的关键。相信随着研究的深入，甘草多糖多层次结构信息会被深入了解，藉此也会促进人们对其生物活性的本质认识。

1 Kitagawa I.Licorice root.A natural sweetener and an important ingredient in Chinese medicine.Pure Appl Chem，2002，74:1189-1198.

2 Martin MD，et al.A controlled trial of a dissolving oral patch concerning glycyrrhiza(licorice)herbal extract for the treatment of aphthous ulcers.Gen Dent，2008，56:206-210.

3 Kim JK，et al.Anti-inflammatory effect of roasted licorice extracts on lipopolysaccharide-induced inflammatory responses in murine macrophages.Biochem Biophys Res Commun，2006，345:1215-1223.

4 Nagai H，et al.Antispasmodic activity of licochalcone A，a species-specific ingredient of Glycyrrhiza inflata roots.J Pharm Pharmacol，2007，59:1421-1426.

5 Sato Y，et al.Isoliquiritigenin，One of the Antispasmodic Principles of Glycyrrhiza Ularensis Roots，Acts in the Lower Part of Intestine.Biol Pharm Bull，2007，30:145-149.

6 Tohma HS，Gülçin I.Antioxidant and Radical Scavenging Activity of Aerial Parts and Roots of Turkish Liquorice(Glycyrrhiza Glabra L.).Int J Food Prop，2010，13:657-671.

7 Shin YW，et al.In Vitro and In Vivo Antiallergic Effects of Glycyrrhiza glabra and Its Components.Planta Med，2007，73:257-261.

8 Fiore C，et al.Antiviral Effects of Glycyrrhiza species.Phytother Res，2008，22:141-148.

9 Lee CK，et al.Effects of the Licorice Extract against Tumor Growth and Cisplatin-Induced Toxicity in a Mouse Xenograft Model of Colon Cancer.Biol Pharm Bull，2007，30:2191-2195.

10 Dhingra D，Sharma A.Antidepressant-like activity of Glycyrrhiza glabra L.in mouse models of immobility tests.Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry，2006，30:449-454.

11 Li YQ.Antiangiogenic Activity of Glycyrrhiza Extract.Phys Procedia，2012，33:144-149.

12 Shim SB，et al.β-Glucuronidase Inhibitory Activity and Hepatoprotective Effect of 18β-Glycyrrhetinic Acid from the Rhizomes of Glycyrrhiza uralensis.Planta Med，2000，66:40-43.

13 Dhingra D，et al.Memory enhancing activity of Glycyrrhiza glabra in mice.J Ethnopharmacol，2004，91:361-365.

14 Zhang Q，Ye M.Chemical analysis of the Chinese herbal medicine Gan-Cao(licorice).J Chromatogra A，2009，1216:1954-1969.

15 Nie XH(聂小华)，et al.In vitro antitumor and immunological activities of effective components in licorice.J Chin Med Mater(中药材)，2003，26:507-509.

16 Tian QL(田庆来)，et al.Research Advances on Pharmacological Activities of Components in Licorice.Nat Prod Res Dev(天然产物研究与开发)，2006，18:343-347.

17 Liu YW(刘晔玮)，et al.A study on the extraction of Glycyrrhiza polysaccharide.Chin Tradit Pat Med(中成药)，2006，28:729-731.

18 Liang RJ.Optimization of Extraction Process of Glycyrrhiza Glabra Polysaccharides by Response Surface Methodology.Carbohydr Polym，2008，74:858-861.

19 Zhao CJ(赵春建)，et al.Supersonic Extraction Process of Glycyrrhiza Polysaccharide and Mathematic Simulation.Chinese J Applied Chem(应用化学)，2004，21:1181-1183.

20 Zhang L(张琳)，et al.Optimization of Ultrasound-assisted Extraction of Polysaccharides from Radix Glycyrrhiza Using Response Surface Analysis.Food Sci(食品科学)，2010，31(16):67-71.

21 Li CJ(李彩君)，et al.Process Technology Study on Optimization of Enzyme Method for Extracting Polysaccharide from Radix Glycyrrhizae by Orthogonal Design.J Guangzhou Univ Trad Chin Med(广州中医药大学学报)，2007，24:323-324.

22 Fu RJ(傅荣杰)，Feng Y(冯怡).Application of microwave extraction technique in extraction of Chinese traditional medicine and natural products.Chin J Chin Mater Med(中国中药杂志)，2003，28:804-807.

23 Zhang ZP(张自萍).Application of microwave assisted extraction technology in the study of polysaccharide.Chin Tradit Herb Drugs(中草药)，2006，37:630-632.

24 Liu BC(刘丙灿)，Fang JN(方积年).Isolation，Purification and Chemical Structure of a Glucan Glycyrrhizia Uralensis Fisch.Acta Pharm Sin(药学学报)，1991，26:672-675.

25 Wang YW(王岳五)，et al.Isolation，Purification and Analysis of a Polysaccharide from Residues of Glycyrrhiza Uralensis Fisch.Acta Sci Nat Univ Nankaiensis(南开大学学报，自科版)，1999，32(4):36-38.

26 Li CY(李春英).Study on the Extraction and Purification Process of Glycyrrhiza Polysaeeharides from Licorice.Heilongjiang:Northeast Forestry University(东北林业大学)，MSc.2006.

27 Zheng XL(郑小亮)，et al.A method for the classification and determination of Glycyrrhiza polysaccharide.Information on Tradit Chin Med(中医药信息)，2009，26(6):28-29.

28 Azeredo J，Oliveira R.A new method for precipitating bacterial exopolysaccharides.Biotechnol Tech，1996，10:341-344.

29 Shimizu N，et al.Characterization of a Polysaccharide Having Activity on the Reticuloendothelial System from the Stolon of Glycyrrhiza globra var.glandulifera.Chem Pharm Bull，1991，39:2082-2086.

30 Cheng AW，et al.Macrophage Immunomodulatory Activity of Polysaccharides Isolated from Glycyrrhiza uralensis Fish.Int Immunopharmacol，2008，8:43-50.

31 Tomoda M，et al.Characterization of Two Polysaccharides Having Activity on the Reticuloendothelial System from the Root of Glycyrrhiza uralensis.Chem Pharm Bull，1990，38:1667-1671.

32 Shimizu N，et al.A Novel Neutral Polysaccharide Having Activity on the Reticuloendothelial System from the Root of Glycyrrhiza uralensis.Chem Pharm Bull，1990，38:3069-3071.

33 Shimizu N，et al.The core structure and immunological activ-ities of glycyrrhizin UA，the main polysaccharide from the root of glycyrrhiza uralensis.Chem Pharm Bull，1992，40:2125-2128.

34 Zhou R(周蓉)，et al.Isolation，purification and high performance capillary electrophoresis analysis of Glycyrrhiza polysaccharide.Chin J Analytical Chem(分析化学)，1999，27:245.

35 Shi K(史坤).Structural Characterization Anatysis and Immune-modulation of Glycyrrhiza Polysaccharide.Tianjin:Tianjin University of Science and Technology(天津科技大学)，MSc.2008.

36 Cong YY，et al.A neutral polysaccharide from Glycyrrhiza inflata.Chem Nat Compounds，2009，45:11-13.

37 Takada K，et al.Core atructure of Glycyrrhizan GA，the Main Ploysaccharide from the stolon of Glycyrrhiza glabra var.glandulifera;Anti-complementary and Alkaline Phosphatase-Inducing Activities of the Ploysaccharide and Its Degradation Products.Chem Pharm Bull，1992，40:2487-2490.

38 Sun RG(孙润广)，Zhang J(张静).A Study of Helical Structure of Glycyrrhiza Polysaccharides by Atomic Force Microscope.Acta Chim Sin(化学学报)，2006，64:2467-2472.

39 Asl MN，Hosseinzadeh H.Review of Pharmacological Effects of Glycyrrhiza sp.and its Bioactive Compounds.Phytother Res，2008，22:709-724.

40 Hong YK，et al.Effects of Glycyrrhiza glabra polysaccharides on immune and antioxidant activities in high-fat mice.Int J Biol Macromol，2009，45:61-64.

41 He XJ，et al.Immunomodulatory activities of five clinically used Chinese herbal polysaccharides.J Exp Integr Med，2012，2:15-27.

42 Wan FC，Cheng AW.Polysaccharide isolated from Glycyrrhiza uralensis Fisch induces intracellular enzyme activity of macrophages.Mediterr J Nutr Metab，2009，1:165-169.

43 He XJ，et al.Down-Regulation of Treg Cells and Up-Regulation of Th1/Th2 Cytokine Ratio Were Induced by Polysaccharide from Radix Glycyrrhizae in H22 Hepatocarcinoma Bearing Mice.Molecules，2011，16:8343-8352.

44 Li XB，et al.Maturation of Murine Bone Marrow-Derived Dendritic Cells Induced by Radix Glycyrrhizae Polysaccharide.Molecules，2012，17:6557-6568.

45 Fang JN(方积年)，Ding K(丁侃).Bioactivities，Isolation and Purification Methods of Polysaccharide.Chin J Net Med(中国天然药物)，2007，5:338-347.

46 Wang YW(王岳五)，et al.Inhibition of Glycyrrhize Ploysaccharide on Virus.Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Nankaiensis(南开大学学报，自科版).2001，34:126-128.

47 Cai YZ，et al.Antioxidant activity and phenolic compounds of 112 traditional Chinese medicinal plants associated with anticancer.Life Sci，2004，74:2157-2184.

48 Hatano T，et al.Two new flavonoids and other constituents in licorice root:their relative astringency and redical scavenging effects.Chem Pharm Bull，1998，36:2090-2097。

49 Yang L(杨玲)，et al.Srudy on Scavenging Free Radical Activity with Polysaccharides in Glycyrrhiza Uralcnsis Fisch.J Tarim Univ，2007，19:1-3.

50 Cong YY(丛媛媛).Studies on Isolation，Purification，Structural elucidation and Biological Activities of Polysaccharides from Glycyrrhiza inflata Bat.in Xinjiang.Xingjiang:Xinjiang Medical University(新疆医科大学)，PhD.2008.

51 Wittschier N，et al.Aqueous extracts and polysaccharides from Liquorice roots(Glycyrrhiza glabra L.)inhibit adhesion of Helicobacter pylori to human gastric mucosa.J Ethnopharmacol，2009，125:218-223.

52 Wittschier N，et al.Large molecules as anti-adhesive compounds against pathogens.J Pharm Pharmacol，2007，59:777-786.

53 Liang RJ，et al.Protective effect of Glycyrrhiza glabra polysaccharides against carbon tetrachloride-induced liver injury in rats.Afr J Microbiol Res，2010，4:1784-1787.