刺孢吸水链霉菌发酵液的化学成分及抗炎活性研究

杨晓军，高 芬

1延安大学化学与化工学院;2延安大学附属医院，延安 716000

刺孢吸水链霉菌是从陕西省定边县酸性土壤中分离得到的一株放线菌。针对放线菌细胞内外次级代谢产物通常不同的特点［1］，本文在研究其菌丝体化学成分的基础上［2］，又对其发酵液的化学成分进行了研究，从中分离得到5个化合物，利用IR、NMR和MS等方法对其结构进行了解析，分别鉴定为芒柄花素 (1)，N-乙酰基-2-(4-羟苯基)乙胺(2)，阿魏酸(3)，3，4，5-三甲基-1，2-苯二酚(4)7，3'-二羟基-4'-甲氧基黄酮(5);此外，还对分离得到的单体化合物1、2、4和5进行了初步抗炎实验研究，现报告如下:

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和培养基

实验菌株分离自中国陕西省定边县酸性土壤中，由延安大学生命科学院微生物研究所任桂梅教授利用16SrRNA基因序列分析法鉴定为刺孢吸水链霉菌Streptosporangium hygroscopicus n.sp.。

种子培养基:淀粉24 g，葡萄糖1 g，蛋白胨3 g，牛肉膏 3 g，酵母膏 5 g，CaCO34 g，水 1000 mL，pH 6.5。

发酵培养基:大豆粉20 g，蛋白胨2 g，葡萄糖20 g，淀粉 5 g，酵母膏 2 g，NaCl 4 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCO32 g，水 1000 mL，pH 6.5，28 ℃，培养 120 h。

1.1.2 仪器和其它材料

XRC-1型显微熔点仪;IR Prestige-21红外光谱仪(日本岛津公司);AV-500型核磁共振仪 (瑞士Bruker公司);MAT-711型质谱仪(美国Thermo公司);Vario EL有机元素分析仪(德国Elementar公司);1525型HPLC(Waters公司);Sephadex LH-20(Pharmacia产品);YLS-7A足趾容积测量仪(山东省医学科学院设备站);柱层析硅胶100～200目(青岛海洋化工厂产品)。CD大鼠，体重90～110 g，由西安交通大学实验动物中心提供，合格证号NO:0003240，许可证号:SCXK(陕)2007-001.;交叉菜胶(美国Sigma公司产品)。阳性对照组(复方七叶皂苷钠凝胶，批号:20100953)山东绿叶制药有限公司.

1.2 方法

1.2.1 发酵方法

将生长良好的斜面接种于种子培养基，28℃、300 rpm摇床培养48 h，再接种于发酵培养基，接种量为1∶10，置于28℃、300 rpm摇床培养120 h。

1.2.2 提取与分离

将发酵120 h的发酵液以3 000 rpm离心，得上清液和菌丝体两部分，上清液过装有 Amberlite XAD-16型大孔吸附树脂的固相萃取柱，然后依次用甲醇和丙酮洗脱吸附在大孔吸附树脂上的次级代谢产物，将甲醇洗脱液减压浓缩蒸干，获得浅黄色粗浸膏，粗样品用水溶解，溶解部分用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取部分经过减压浓缩后拌硅胶(200～300目)、晾干、上硅胶柱分离，以氯仿∶甲醇(V∶V)=20∶1→18∶1→16∶1→14∶1→12∶1→10∶1→8∶1→6∶1→4∶1梯度洗脱并分段收集得组分C、D和E。将组分C、D和E继续上Sephadex LH-20凝胶柱，丙酮为洗脱剂进行纯化，各流分以HPLC(C-18色谱柱，4.6 mm ×150 mm，5 μm)检测其纯度。从组分C中分离得到化合物2和4;从组分D中分离得到化合物1和5;从组分E中分离得到化合物3。

1.2.3 化合物1、2、4和5对交叉菜胶致大鼠足趾肿胀的影响

将42只CD大鼠随机分为正常对照组(normal)、模型组、阳性对照组(复方七叶皂苷钠凝胶)和化合物1、2、4和5组，共7组。每组6只，雌雄各半。正常组大鼠右后足趾皮下注入0.1 mL蒸馏水/只，其余6组均在大鼠右后足趾皮下注射1%交叉菜胶溶液(配置方法见文献［3］)0.1 mL/只。致炎2 h后，阳性对照组和化合物1、2、4和5组每日定时腹腔注射给药1次(剂量均为15 mg/kg)，连续给药5 d。在致炎后第10 d，用排水法求出肿胀度，计算抑制率:抑制率(%)=(模型组平均肿胀度-给药组平均肿胀度)/模型组平均肿胀度×100%。

2 结果

2.1 结构鉴定

化合物1 白色固体，mp.254～255℃，与三氯化铁反应为阳性，提示含有酚羟基;ESI(+)-MS:(m/z)269［M+H］+，307［M+K］+;从元素分析得知碳、氢的含量分别为71.59%和4.51%;质谱结合元素分析提示该化合物的分子式为C16H12O4;IR(KBr)νmaxcm-1:3 133(-OH)，3 031(Ar-H 伸缩振动)，1 641(共轭 C=O)，1 604，1 572，1 503(苯环骨架伸缩振动)，2 978，2 843，1 383(-CH3)。1H NMR(DMSO-d6，500 MHz)δ:10.81(1H，brs，7-OH)为1个酚羟基质子信号;8.33(1H，s，H-2)为异黄酮2位质子的特征信号;7.93(1H，d，J=8.7 Hz，H-5)，6.95(1H，dd，J=8.7，2.4Hz，H-6)，6.85(1H，d，J=2.4 Hz，H-8)，7.47(2H，d，J=8.2 Hz，H-2'，6')，6.98(2H，d，J=8.2 Hz，H-3'，5')，3.76(3H，s，-OCH3)。13C NMR(DMSO-d6，125 MHz)δ:153.7(C-2)，123.3(C-3)，174.9(C-4)，127.2(C-5)，115.4(C-6)，162.9(C-7)，101.9(C-8)，159.3(C-9)，116.7(C-10)，124.0(C-1')，130.2(C-2'，6')，113.8(C-3'，5')，157.6(C-4')，55.6(-OCH3)。以上数据与文献［4］报道的芒柄花素数据一致，故化合物1为芒柄花素。

化合物2 白色固体，mp.134～136℃。三氯化铁反应阳性，示有酚羟基存在。ESI(+)-MS:(m/z)180 ［M+H］+，381［2M+Na］+;从元素分析得知碳、氢和氮的含量分别为67.01%、7.28%和7.79%;质谱结合元素分析提示该化合物的分子式为 C10H13NO2;IR(KBr)νmaxcm-1:3341～3229(-NH，-OH)，3029(Ar-H 伸缩振动)，1639(C=O)，1608，1527，1508(苯环骨架伸缩振动)，847(1，4-二取代苯的结构)。1H NMR(DMSO-d6，500 MHz)δ:9.21(1H，brs，4'-OH)，7.86(1H，brs，-NH)，7.01(2H，d，J=8.2 Hz，H-2'，6')，6.69(2H，d，J=8.2 Hz，H-3'，5')，3.17(2H，m，H-1)，2.56(2H，m，H-2)，1.85(3H，s，CH3CO-);13C NMR(DMSO-d6，125 MHz)δ:169.2(-C=O)，156.2(C-4')，130.1(C-1')，129.7(C-2'，6')，115.3(C-3'，5')，40.5(C-1)，34.0(C-2)，23.2(-CH3)。以上数据与文献［5］报道的N-乙酰基-2-(4-羟苯基)乙胺数据一致，故化合物2为N-乙酰基-2-(4-羟苯基)乙胺。

化合物3 白色针晶(甲醇)，mp.172～173℃，IR(KBr)cm-1:3 429(-OH)，1 690(羧 C=O)，1 627，1 516，1 498(苯环骨架伸缩振动)。ESI(+)-MS显示准分子离子峰m/z 195［M+H］;元素分析得碳、氢的百分含量分别为61.78、5.23;质谱和元素分析推出该化合物的分子式C10H10O4，相对分子质量为 194 。1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ:3.82(3H，s，-OCH3)，6.37(1H，d，J=15.4 Hz，H-8)，6.75(d，J=8.2 Hz，H-5)，7.09(dd，J=8.2，2.0 Hz，H-6)，7.26(d，J=2.0 Hz，H-2)，7.51(d，J=15.4 Hz，H-7);13C NMR(CDCl3，125 MHz)δ:55.3(-OCH3)，112.2(C-2)，115.3(C-5)，115.9(C-6)，122.5(C-8)，125.6(C-1)，144.5(C-7)，147.6(C-4)，150.2(C-3)，167.8(C-9)。其理化数据与文献对照基本一致［6］，故鉴定为阿魏酸。

化合物4 白色针晶(甲醇)，mp.113～115℃，三氯化铁反应阳性，示有酚羟基存在。ESI(+)-MS:(m/z)153［M+H］+;从元素分析得知碳、氢的含量分别为70.98%和7.77%;质谱结合元素分析提示该化合物的分子式为C9H12O2;IR(KBr)νmaxcm-1:3 275(-OH)，3 039(Ar-H 伸缩振动)，1 601，1 522(苯环骨架伸缩振动)，1 309，1 046，865(1，2，3，4，5-五取代苯的结构);1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ:8.83(1H，brs，1-OH)，7.94(1H，brs，2-OH)，6.29(1H，s，H-6)，2.03(3H，s，3-CH3)，2.08(3H，s，4-CH3)，2.14(3H，s，5-CH3);13C NMR(CDCl3，125 MHz)δ:154.3(C-1)，153.7(C-2)，135.6(C-3)，115.6(C-4)，110.2(C-5)，109.5(C-6)，9.7(3-CH3)，11.3(4-CH3)，19.8(5-CH3)。以上数据与文献［7］报道的 5，7，4'-三羟基异黄酮数据一致，故化合物 4 为 3，4，5-三甲基-1，2-苯二酚。

化合物5 浅黄色针晶，m.p.250～252℃。三氯化铁反应阳性，示有酚羟基存在。ESI(+)-MS:(m/z)285［M+H］+，307［M+Na］+;从元素分析得知碳、氢的含量分别为67.32%和3.98%;质谱结合元素分析提示该化合物的分子式为C16H12O5;IR(KBr)νmaxcm-1:3 221 ～3 396(-OH)，3 027(Ar-H 伸缩振动)，1 607，1 588，1 473(苯环骨架伸缩振动);1H NMR(CD3OD，500 MHz)δ:10.82(1H，brs，7-OH)，9.43(1H，brs，3'-OH)为 2 个酚羟基质子信号;6.67(1H，s，H-3)为黄酮3位质子的特征信号;7.86(1H，d，J=8.5 Hz，H-5)，6.90(1H，dd，J=8.5，2.0Hz，H-6)，6.95(1H，d，J=2.0 Hz，H-8)，7.40(1H，d，J=2.0 Hz，H-2')，7.03(1H，d，J=8.5 Hz，H-5')，7.55(1H，dd，J=8.5，2.0Hz，H-6')，3.85(3H，s，-OCH3).13C NMR(CD3OD，125 MHz)δ:162.4(C-2)，105.6(C-3)，176.4(C-4)，126.5(C-5)，115.2(C-6)，157.9(C-7)，102.3(C-8)，162.7(C-9)，116.0(C-10)，123.4(C-1')，113.1(C-2')，146.4(C-3')，159.7(C-4')，112.3(C-5')，117.8(C-6')，56.2(-OCH3)。以上数据与文献［8-9］报道的7，3'-二羟基-4'-甲氧基黄酮数据一致，故化合物5为7，3'-二羟基-4'-甲氧基黄酮。

2.2 化合物1、2、4和5对交叉菜胶所致大鼠足趾肿胀的影响

实验结果表明在给药剂量相同的条件下，阳性对照组和化合物1、2、4和5对交叉菜胶所致大鼠足趾肿胀的抑制率分别为:48.8%，47.3%，16.8%，13.6%和50.4%。

3 讨论

本实验从一株耐酸链霉菌的发酵液中分离得到5个单体化合物，其中化合物1、4和5首次从放线菌中分离得到。抗炎实验研究表明，化合物1和5具有较强的抗炎作用;化合物3虽未进行抗炎实验研究，但是有文献报道它具有较强抗炎作用［10］，因此本实验初步研究结果为从本菌中寻找抗炎活性化合物打下了一定的基础。

1 Xu LH(徐丽华)，Li WJ(李文均)，Liu ZH(刘志恒)，et al..Actinomycete Systematics-Principle，Method and Practice(放线菌系统学—原理方法及实践).Beijing:Science Press，2007.23-24.

2 Yang XJ(杨晓军).Chemical constituents in the mycelia of an acidoduric streptomycetes.Acad J Sec Mil Med Univ(第二军医大学学报)，2011，32:477-480.

3 Hu CX(胡晨霞)，He JQ(何嘉琪)，Liu G(刘戈)，et al.Anti-inflammatory effect of rhizoma curcumae longae on collagen-induced arthritis rats.Tradit Chin Drug Res Clin Pharm(中药新药与临床药理)，2010，21:363-365.

4 Zheng Y，Liu H，Bai Y J，et al.Five flavonoids from spatholobus suberectus.China J Chin Mater Med(中国中药杂志)，2008，33:152-154.

5 Zhang BH(张炳火).Chemical studies on the solid fermentation products of actinomycete JXJ-45.Nat Prod Res Dev(天然产物研究与开发)，2008，20:650-651.

6 Wu SH(吴少华)，ISABEL Sattler，Li MG(李铭刚)，et al.Chemical studies on the secondary metabolites from the alkalophilic actinomycete YIM-80147.Nat Prod Res Dev(天然产物研究与开发)，2004，16:286-289.

7 Young AJ，Yang MG，Youn YL.Characteristic oxidative aromatization pattern of isophorone，4-hydroxyisophorone and rearrangement of 4-oxoisophorone under a strong acidic condition.Bull Kor Chem Soc，1991，12:253-254.

8 Wang CF(王彩芳)，Li JP(李俊平)，Li RR(李娆娆)，et al.Structural elucidation of three flavonoids extracted from the Rhizomes of Ligularia vellerea by NMR spectroscopy.Chin J Magn Res(波谱学杂志)，2009，26:264-271.

9 Wang XK(王秀坤)，Li JS(李家实)，Wei LX((魏璐雪)，et al.Studies on the flavone constituents in the seeds of Sophora viciifolia Hance.China J Chin Mater Med(中国中药杂志)，1996，21:165-166.

10 Hu HJ(胡慧娟)，Hang BQ(杭秉茜)，Wang PS(王朋书).Antiinflammatory effects of ferulic acid.J Chin Pharm Univ(中国药科大学学报)，1990，21:279-282.