三种突变GRK4 转基因小鼠的血压动态分析

鲍丹，董伟，刘宁，张旭，吕丹，张连峰

(中国医学科学院医学实验动物研究所，北京协和医学院比较医学中心，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室，北京 100021)

高血压是严重危害人类健康的常见心血管病之一，目前全球高血压患者约有10 亿，如不采取积极有效的预防措施，预计到2025 年，全球的高血压患者可能会再增加80%［1］。因此，高血压的防治具有重要的现实意义。

多巴胺是由交感神经系统产生的主要的儿茶酚胺类物质之一，当肾脏钠浓度升高时，局部产生的多巴胺通过与肾近曲小管上的D1和D2样受体结合，抑制钠的重吸收，促进尿钠排泄，调节血压。研究发现，遗传性高血压大鼠和人类原发性高血压患者肾脏多巴胺功能均受损［2－5］，原因是多巴胺D1受体(dopamine D1receptor，D1R)功能减弱，其活性受G蛋白偶联受体激酶(G－protein－coupled receptor kinases，GRKs)调控。G 蛋白偶联受体激酶4(G－protein－coupled receptor kinase 4，GRK4)是GRKs 家族成员，编码GRK4 的基因定位4p16.3，该位点已被证实与高血压的发生相关［6］。在正常情况下，GRK4 主要在睾丸和子宫肌层中表达，脑和肾脏组织中表达低［7－9］;而在自发性高血压大鼠和人类原发性高血压患者肾脏中GRK4 表达增高［9］，活性增高的GRK4 一方面可导致肾脏D1R 功能受损，另一方面可增强血管紧张素1 型受体(angiotensin type 1 receptor，AT1R)的功能，从而导致肾脏尿钠排泄障碍，血压升高。

已有报道，GRK4 的突变与肾脏促尿钠排泄功能受损和高血压的发生密切相关，其中R65L(rs2960306 )、A142V(rs1024323 )和 A486V(rs1801058)是现阶段研究频率较高的三个突变。研究发现，GRK4 基因突变的发生频率具有种族特异性，如GRK4γR65L和GRK4γA142V在加纳人和黑种人中的发生率较高，而GRK4γA486V在中国人、日本人和白种人中的发生率较高［10－11］。目前已经发现在意大利人群中GRK4γA486V同高血压显著相关(P =0.034)［12］。在另一个在澳大利亚人群中的研究也发现GRK4γA486V同高血压密切相关(P =0.02)，并且还发现GRK4γR65L和GRK4γA142V与男性舒张压呈正相关(P =0.009，P =0.002)［13］。在对中国北方汉族人群的研究中发现，GRK4γR65L、GRK4γA142V和GRK4γA486V的同时存在可使高血压的发生风险较无突变人群高6 倍［14］。在日本人群中，若GRK4γR65L、GRK4γA142V和GRK4γA486V三个突变同时存在，其对盐敏感性高血压发生的预测准确率高达94%［11］。

基于上述现状，本研究通过建立GRK4γ 野生型和三种GRK4γ 基因突变转基因小鼠，并对其血压进行动态分析。拟为研究GRK4γ 突变与高血压发病机制的关系提供有价值的疾病动物模型。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

C57BL/6J 小鼠和ICR 小鼠购自北京市维通利华实验动物技术有限公司［SCXK(京)2012－0001］。GRK4γwt/R65L/A142V/A486V转基因小鼠由本实验室制作［SCXK(京)2013－0002］。本实验所用动物均在无特定病原体(specific－pathogen free，SPF)的饲养间［SYXK(京)2009－0003］饲养。实验中涉及动物的操作程序已经得到中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会的批准(ILAS－GC－2012－001)。

1.1.2 主要试剂及仪器

突变试剂盒购自美国Stratagene 公司。限制性内切酶如Nhe I、Xba I 和Pvu I 以及PCR 相关试剂均购自中国宝生物工程有限公司。PCR 引物由中国上海英俊生物技术有限公司合成。NC 膜购自美国Millipore 公司。鼠抗GRK4 抗体购自德国Abnova 公司。HRP－偶联的羊抗鼠抗体和HRP－偶联的GAPDH 单克隆抗体分别购自美国Santa Cruz 公司和中国康成生物公司。BP－98A 智能无创血压计购自日本SoftronTM公司。

1.2 方法

1.2.1 GRK4γwt/R65L/A142V/A486V表达载体的构建及转基因

以pCMV6－XL－h－GRK4 质粒(OriGene，美国，Clone ID NM_001004056.1)为模板，用PCR 法扩增人GRK4 全长cDNA，以此为模板，以突变试剂盒标准操作程序分别将65 位精氨酸(R)突变为亮氨酸(L)、142 位丙氨酸(A)突变为缬氨酸(V)和486 位丙氨酸(A)突变为缬氨酸(V)，即获得突变体GRK4γR65L、GRK4γA142V和GRK4γA486V，经测序并比对正确后，PCR 扩增获得带有Nhe I 和Xba I 酶切位点的完整人源 GRK4γ 野生型、GRK4γR65L、GRK4γA142V和GRK4γA486V基因，将扩增片段插入pMD18T 载体，经测序并比对正确后，以Nhe I 和Xba I 酶切回收 GRK4γ 野生型、GRK4γR65L、GRK4γA142V和GRK4γA486V片段，并分别克隆入鸡β－肌动蛋白启动子下游构建全身表达人GRK4γ 野生型、GRK4γR65L、GRK4γA142V和GRK4γA486V表达载体。提取并酶切鉴定质粒正确后，再用Pvu I 将其线性化，Sephedex G50 柱纯化DNA 片段，获得鸡β－肌动蛋白启动的人 GRK4γ 野生型、GRK4γR65L、GRK4γA142V和GRK4γA486V基因的转基因片段，注射前将转基因片段浓度调整至5 ng/μL，用显微注射法将线性化的转基因载体注射到C57BL/6J 小鼠的受精卵中，用ICR 小鼠作假孕受体，制备转基因小鼠。

1.2.2 PCR 鉴定GRK4γwt/R65L/A142V/A486V转基因小鼠的基因型

转基因小鼠在出生9～14 d 用剪趾法标记，收集剪下的组织，用碱裂解法提取基因组DNA，用PCR 法对转基因小鼠进行基因型检测。PCR 上游引物为:5′－GATGAGGACCGAAGTGATTGT，下游引物为:5′－TTGCCCAGGTTGTAAATGTG。PCR 反应体系20 μL。反应条件:94℃预变性3 min，94℃变性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸30 s，重复变性到延伸29 次，完成30 个循环。目的基因片段为623 bp。

1.2.3 Western Blot 鉴定GRK4γwt/R65L/A142V/A486V蛋白的表达

提取首建鼠的仔代阳性转基因小鼠和同窝转基因阴性(non－transgenic，NTG)小鼠心脏、肾脏和肾上腺组织总蛋白，进行SDS－PAGE 凝胶电泳，蛋白转移至NC 膜上，置于5% 脱脂奶粉中封闭，鼠抗GRK4 抗体检测鼠源GRK4 和转入的人源GRK4 蛋白的表达水平，HRP－偶联的羊抗鼠抗体结合一抗，HRP－偶联的GAPDH 单克隆抗体作为内参。

1.2.4 无创血压计测量GRK4γwt/R65L/A142V/A486V转基因小鼠血压

将小鼠提前半小时放入血压测量实验室，让小鼠适应测试环境。按智能无创血压计说明书和Steven E 报道的方法进行小鼠尾部血压测量［15］。

1.2.5 高盐饲料喂养GRK4γA486V转基因小鼠

于2 月龄给予NTG 小鼠和GRK4γA486V转基因高盐饲料(氯化钠含量为4%，，连续喂养4 周后用智能无创血压计测量血压并恢复正常饲料(氯化钠含量为0.6%)喂养。

1.6 统计分析

2 结果

2.1 GRK4γwt/R65L/A142V/A486V转基因小鼠的建立

测序结果表明PCR 法克隆的片段同已报道人组织GRK4 序列完全一致(GeneBank:NC_000004)，将人 GRK4γ 野生型、GRK4γR65L、GRK4γA142V和GRK4γA486V基因分别插入鸡β－肌动蛋白启动子下游，构建得到人 GRK4γ 野生型、GRK4γR65L、GRK4γA142V和GRK4γA486V转基因表达载体(图1A)并用显微注射法制备转基因小鼠。提取小鼠基因组DNA，用PCR 法扩增623 bp 的目的片段，鉴定小鼠基因型(图2B)。提取心脏、肾脏和肾上腺组织总蛋白，用GRK4 抗体进行Western Blot 分析，确定转基因小鼠GRK4 的高表达(图1C)。通过比较NTG和转基因小鼠中GRK4 表达水平，筛选到在心脏、肾脏和肾上腺均高表达GRK4 基因的转基因小鼠品系。

2.2 正常饮食 GRK4γ 野生型、GRK4γR65L、GRK4γA142V和GRK4γA486V 转基因小鼠血压动态对比分析

NTG 和转基因阳性小鼠于2、4 和8 月龄进行血压动态分析。结果显示，NTG 和转基因阳性小鼠平均动脉血压(mean arterial pressure，MBP)［平均动脉血压 = 舒张压 + 1/3(收缩压﹣舒张压)］均随着年龄的增长而增加。与NTG 小鼠相比，GRK4γ野生型和 GRK4γR65L转基因小鼠血压正常;GRK4γA142V转基因小鼠在8 月龄时血压显著升高(P=0.009);而GRK4γA486V转基因小鼠在正常的钠盐摄入情况下并未出现高血压表型(图2)。说明，外源性转入人源 GRK4γ 野生型、GRK4γR65L和GRK4γA486V突变不会影响正常钠盐摄入情况下血压水平，而GRK4γA142V突变即使在正常钠盐摄入情况下仍会引起血压升高。

2.3 高盐饮食GRK4γA486V转基因小鼠血压动态对比分析

于2 月龄时将NTG 和GRK4γA486V转基因小鼠随机分成四组，即NTG 正常饮食组(n = 8)、GRK4γA486V正常饮食组(n =5)、NTG 高盐饮食组(n=6)和GRK4γA486V高盐饮食组(n =6)。正常膳食饮食组饲料中氯化钠含量为0.6%，高盐饮食组饲料中氯化钠含量为4%，连续喂养4 周后恢复正常饮食，并对各组小鼠进行血压动态分析。结果显示，经过高盐饮食刺激，与正常饮食组NTG 小鼠相比，高盐饮食组NTG 小鼠MBP 虽有所升高但差异无显著性;而高盐饮食组GRK4γA486V转基因小鼠较正常饮食组GRK4γA486V转基因小鼠MBP 显著升高(P =0.0007)，且MBP 变化值为7.53 mmHg(图3)。临床上，将因钠盐摄入量增多而导致的MBP 升高值≥7 mmHg 的高血压定义为盐敏感性高血压［16］。由此可知，GRK4γA486V突变诱导高血压属于盐敏感性高血压。

图1 GRK4γ 野生型基因和三种GRK4γ 基因突变转基因小鼠的建立Note:1.Blank control;2.negative control;3.positive control;5，8，11，13:positive tranggenic Mice;4，6，7，9，10，12:Negative transgenic mice.A.Establishment of GRK4γ wild－type gene and three GRK4γ variant transgenic vector;B.Genotyping GRK4γ wild－type gene and three GRK4γ variant transgenic mice by PCR;C.Expression level of target gene in the heart，kidney and adrenal gland by Western blot.Fig.1 Establishment of GRK4γ wild－type gene and three GRK4γ variant transgenic mice

图2 正常饮食GRK4γ 野生型基因和三种GRK4γ 基因突变的转基因小鼠血压动态对比分析(Note:* P＜0.01;＊＊P＜0.01)Fig.2 Contrastive analysis of dynamic changes of blood pressure of GRK4γ wildtype gene and three GRK4γ variant transgenic mice taking normal diet

图3 高盐饮食GRK4γA486V转基因小鼠血压动态对比分析Fig.3 Contrastive analysis of dynamic changes of blood pressure of GRK4γA486V transgenic mice taking in high－salt diet

3 讨论

多巴胺能和肾素－血管紧张素系统是两个最主要的血压调控途径，二者与细胞间第二信使系统协同调节体内水钠平衡，GRK4 则在多巴胺介导的尿钠排泄中发挥重要的作用。研究表明，GRK4γ 野生型可以促进细胞间的D1R 募集至细胞膜，与第二信使偶联，增加钠运输［17］;而GRK4γ 突变体却可通过使D1R 磷酸化及内在化，阻止其再循环至细胞膜，并引起D1R 与第二信使解偶联，钠转运减少，钠钾离子ATP 酶活性降低，细胞内钙离子浓度增高和血管平滑肌活性增高等一系列功能异常，最终导致高血压的发生。再者，GRK4γ 突变体还可通过调控其他基因的表达，如增加AT1R 的表达，增强抗尿钠排泄效应，刺激血压升高［18］。Felder 等［19］发现，抑制肾GRK4 的表达可恢复高血压患者肾近曲小管D1R功能并改善自发性高血压大鼠的血压水平。但目前对GRK4 的表达调控所知甚少，仅Gildea 等［20］在近期发现转录因子c－Myc 可与GRK4 启动子结合，正调控人肾脏近曲小管细胞中GRK4 蛋白的表达。c－Myc 的抑制剂10074－G5 可完全抑制由磷酸化c－Myc诱导的GRK4 表达增高，说明GRK4 是转录因子c－Myc 的下游分子。此研究还发现，肾脏近曲小管细胞自分泌的血管紧张素Ⅱ也可刺激磷酸化c－Myc 和GRK4 的表达，若给予血管紧张素ⅡAT1R 的抑制剂洛沙坦不仅可抑制c－Myc 活性及GRK4 的表达，还能恢复D1R 与第二信使的偶联，改善血压水平。

本文建立了人GRK4γ 野生型、GRK4γR65L、GRK4γA142V和GRK4γA486V基因转基因小鼠，并对其进行血压动态对比分析。结果发现，与NTG 小鼠相比，GRK4γ 野生型和GRK4γR65L突变转基因小鼠血压正常;GRK4γA142V突变转基因小鼠在正常的钠盐摄入情况下即可发生高血压，而GRK4γA486V突变转基因小鼠只有在增加钠盐摄入情况下才发生高血压。Felder［19］和Wang 等［21］也得出类似的结果，说明GRK4γ 的不同突变会引起不同类型的高血压。

GRK4γ 基因的突变与高血压的关系对临床上防治高血压具有重要的指导意义，已有报道，非洲裔美国高血压患者若其带有GRK4γR65L/A142V突变，则对β－肾上腺素受体阻滞剂不敏感［22］;而血管紧张素受体阻滞剂可明显降低带有GRK4γA142V突变的日本高血压患者的血压水平［23］。

综上所述，GRK4，尤其是人GRK4γ 亚型，在调节D1R 生物学功能中发挥重要作用，与高血压密切相关。人GRK4 突变体不仅可以预测高血压的类型(如，自发性高血压、盐敏感性高血压)，还可预期高血压患者对抗高血压药物的反应。本文建立GRK4γA142V转基因小鼠可作为自发性高血压动物模型，GRK4γA486V转基因小鼠可作为盐敏感性高血压动物模型，为研究GRK4γ 突变与高血压发病机制的关系提供了有价值的疾病动物模型。

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