矮丛蓝莓茎段组织的培养

王新苗,张淑华,索云成,刘婧怡,齐安国

（1.伊春林业学校,黑龙江伊春153000；2.河南科技学院,河南新乡453003）

矮丛蓝莓Vaccinium angustifolium为杜鹃花科E r i c a c e a e越橘属Vaccinium植物,小浆果类果树,又称矮丛越橘[1].其营养丰富,是美味滋补佳品,不但可以鲜食,还可以制成多种加工品,在国际市场上享有盛誉.传统的扦插、压条等繁殖方法繁殖系数和出苗率低,难以满足迅速推广优良品种的需要.因此,本文采用矮丛蓝莓茎段作为外植体建立一个离体再生体系,以期为矮丛蓝莓快速繁殖和进一步开发利用提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试矮丛蓝莓品种,取自辽宁省抚顺市清原县,分别为：‘北极星’（Polaris）、‘美登’（BlomIDon）.

1.2 试验方法

1.2.1 初代培养在4月初进行灭菌方案的筛选.以‘北极星’、‘美登’带腋芽茎段为试材,用流水冲洗20~30 m i n.在超净工作台上,先用体积分数为75%的乙醇浸渍30 s,再用无菌水冲洗1遍,接着以质量分数为0.1%的H g C l2、质量分数为2%的Na ClO为灭菌剂,对应不同的消毒时间进行进一步消毒,最后用无菌水冲洗5遍,待用.以上操作采用WPM+6-B A2.0 mg/L+NAA0.2 mg/L作为培养基,每个处理接种40个外植体,重复3次.30d后调查各处理的死亡率、污染率及成活率,筛选出外植体消毒的最佳方案.以WPM培养基为基本培养基,附加不同浓度的6-B A、NAA,将灭菌后的‘北极星’、‘美登’的带腋芽茎段分别接种于上述培养基上,每天观察6-B A及NAA组合对外植体诱导的影响,30 d后进行数据统计.

1.2.2 继代与增殖培养以WPM培养基为基本培养基,采用L9（34）正交试验做3因素3水平处理,测定3种植物生长调节剂（6-B A、NAA、ZT）处理30 d后的增殖系数和生长状况；将接种在WPM+6-B A0.5 mg/L+NAA0.1 mg/L+ZT2 mg/L基本培养基上的外植体,分别经0、7、14 d暗培养处理,然后转移到光照下培养30 d后调查,测定暗培养对增殖培养的影响；测定不同转种周期（30、40、50 d）的试管苗嫩梢形态和生长状况,以选择外植体最佳的转种周期.

1.2.3 壮苗及生根培养不定芽增殖得到的植株表现细弱,为了让其生根,本研究在不添加任何生长调节剂的MS培养基上进行壮苗培养.20 d后,选择生长健壮的植株,在1/2 MS培养基上诱导其生根,每个处理30瓶,每瓶1个单株,重复3次.30 d后观察统计生根率及试管苗生长情况.

1.3 试验结果评测指标

材料接种后,定期观察记录生长情况,主要统计指标及计算公式如下[2]：

死亡率/%=死亡的外植体数/接种的外植体总数×100

污染率/%=污染的外植体数/接种的外植体总数×100

成活率/%=成活的外植体数/接种的外植体总数×100

诱导率/%=萌发出叶片的外植体数/接种的外植体总数×100

生根率/%=生根的外植体数/接种的外植体总数×100

增殖系数/%=增殖后的芽苗数/接种的外植体总数×100

2 结果与分析

2.1 初代培养

2.1.1 不同消毒处理对外植体表面的消毒效果不同消毒处理对外植体表面的消毒效果见表1.

表1 不同灭菌方式的灭菌效果Tab.1 Effect of different sterilizati on methods

由表1可知,不同处理对‘北极星’、‘美登’的死亡率、污染率和成活率影响不同.使用质量分数为0.1%的H g Cl2灭菌时,A2处理2个品种的成活率均最高,分别为90%、92.5%,灭菌效果明显,与其他处理差异显著.随着HgCl2消毒时间的延长,污染率均降低,但对外植体造成了伤害,致使死亡率升高,不同品种之间存在一定差异.使用质量分数为2%的Na ClO灭菌时,‘北极星’A5处理成活率最高为75%,而‘美登’A4处理成活率最高为77.5%,这可能与材料生长状态有关.就灭菌试剂的种类而言,Hg Cl2灭菌效果明显好于Na ClO的效果.

综合分析死亡率、污染率和成活率的测定结果,2个品种均确定A 2处理即体积分数为75%的乙醇30 s+质量分数为0.1%的Hg Cl28 m in为最佳消毒处理方案.

2.1.26-B A及NA A组合对外植体诱导的影响6-B A及NAA组合对外植体诱导的影响见表2.

表2 6-BA及NAA组合对带腋芽茎段诱导率的影响Tab.2 Effect of different combinations of 6-BA and NAA on induction of stem with axillary bud

由表2可知,‘北极星’以WPM+6-B A3mg/L+NAA0.2mg/L为最佳诱导培养基,‘美登’则以WPM+6-B A2 mg/L+NAA0.2 mg/L为最佳诱导培养基,其诱导率分别为72.5%和74.29%,与其他激素组合差异显著.2个品种的诱导培养基相差较大,这说明不同基因型的品种在腋芽的诱导上存在较大差异.在低浓度6-B A时,萌发的叶片大,而且叶色深绿,叶间距较大.而6-B A浓度增大时,叶片变得窄小,叶色变浅,叶间距缩短,叶片呈丛生状.在同样的6-B A浓度下,NAA质量浓度为0.1~0.2 mg/L时,诱导率差异不显著,苗芽生长健壮,颜色为绿色或深绿色；当NAA浓度为0.3 mg/L时,虽然诱导率差异不显著,但是愈伤组织略有增加.

2.2 继代与增殖培养

2.2.1 不同生长调节剂组合对试管苗增殖生长的影响不同生长调节剂组合对‘北极星’、‘美登’试管苗增殖生长的影响分别见表3、表4.

表3 不同生长调节剂组合对‘北极星’增殖生长的影响Tab.3 Effect of different hormone combinations on proliferation of' Polaris'

由表3极差分析可知,本试验3个因素对‘北极星’的增殖影响依次是ZT＞6-B A＞NAA,这表明ZT是‘北极星’增殖的重要因素.通过分析均值（K）,可以推断最佳组合为C 3,此时的增殖系数最高达4.83,与其他处理组合差异显著,并且试管苗生长健壮,芽苗分化较多,叶片嫩绿,展开,效果最好.因此,‘北极星’增殖适宜的培养基为WPM+6-B A0.3 mg/L+NAA0.5 mg/L+ZT 2 mg/L.由表4可知,本试验3个因素对‘美登’的增殖影响依次是ZT＞6-B A＞NAA.通过分析均值（K）,可以推断最佳组合为6-B A1 mg/L+NAA0.1 mg/L+6-B A2 mg/L.从实际观察数据来看,C 7处理增殖系数最高,达到5.21,与其他处理组合差异显著,并且试管苗长势较好,分化较快,叶片浓绿,展开叶片较多,生长健壮.因此,应选择WPM+6-B A1 mg/L+NAA0.05 mg/L+ZT 2 mg/L为最适培养基.

表4 不同生长调节剂组合对‘美登’增殖生长的影响Tab.4 Effect of different hormone combinations on proliferation of' BlomIDon'

2.2.2 光照条件对试管苗增殖的影响光照条件对试管苗增殖的影响见表5.由表5可知,经过7 d暗培养,2个品种的增殖系数均达到最高,分别为3.26和4.08,与其他处理差异显著.并且此时的嫩茎粗壮,叶色嫩绿,丛生芽较多,生长较快,说明经过7 d暗培养,促进了丛生芽的生长和分化,对苗有利.虽然接种后直接进行光下培养,2种试管苗也能正常生长,但是其丛生芽分化较少,增殖较慢；而接种后经过14 d暗培养,试管苗的叶色发黄,叶片卷曲,整个植株都出现松散的状况,增殖效果也不佳.因此,接种后7 d暗培养对‘北极星’和‘美登’增殖效果最佳.

表5 不同光照条件对继代增殖的影响Tab.5Effect of different light conditions on proliferation

2.2.3 不同转种周期对试管苗增殖的影响不同转种周期对试管苗增殖的影响见表6.

表6 不同转种周期对继代增殖的影响Tab.6Effect of different cycle of turning on proliferation

由表6可知,试验中‘北极星’和‘美登’的转接周期有些差异.‘北极星’在培养30 d时,增殖系数最高为4.25,与其他处理差异显著,叶色嫩绿,生长较快,丛生芽分化较多.随着时间的延长,大部分叶片保持绿色,有些嫩梢顶端枯黄,下部叶变黄,少数枯死；50 d时,上部叶也开始变黄,有些茎尖已经干枯,下部叶片几乎全部枯死.‘美登’在培养30 d时,增殖系数为2.19,叶片生长状况较好,上叶嫩绿,下叶深绿；在培养40 d时,增殖系数上升为3.07,与其他处理差异显著,叶片嫩绿,丛生芽较多,生长较快；但50 d后,增殖系数下降至1.47,叶片枯黄,植株生长缓慢,甚至枯死.所以,‘北极星’最佳转种周期为30 d,而‘美登’最佳转种周期为40 d.

2.3 壮苗及生根培养

壮苗后,生根培养约2周时,小苗底部开始形成白色的根点,20 d左右即可长出小根,根白色.不同浓度I B A和活性炭（A C）用量对‘北极星’和‘美登’生根的影响见表7.

表7 不同浓度的生长素和活性炭对试管苗生根的影响Tab.7 Effect of different auxin and AC on rooting of rooting plantlets

由表7可知,在不加I B A和活性炭的培养基中,均没有根形成.在附加不同浓度I B A和活性炭的培养基上,2种矮丛蓝莓均可生根,但生根效果不同.‘北极星’以1/2 MS+I B A0.2 mg/L+活性炭0.1%作为生根培养基效果最好,生根率达53.33%,根多,粗壮,与其他组合差异显著；‘美登’以1/2 MS+I B A0.1 mg/L+活性炭0.1%生根率最高,达到66.67%,均匀整齐,植株生长健壮.

3 结论与讨论

木本植物组织培养的困难之一是建立无菌材料[2].本文以2种矮丛蓝莓茎段作外植体,筛选出最佳的灭菌方式均为：体积分数为75%的乙醇30 s+质量分数为0.1%的H g C l28 min,此时成活率均最高.

已有研究表明,and ers on、WPM和MS培养基均适合蓝莓组培,但WPM的效果最好[3].本试验采用WPM、1/2 MS作为基本培养基,试验证明,‘北极星’的启动培养基宜采用WPM+6-B A3 mg/L+NAA0.2 mg/L,增殖培养基为WPM+6-B A0.3 mg/L+NAA0.5 mg/L+ZT 2 mg/L,生根培养基为1/2 MS+I B A0.2 mg/L+A C 0.1%；‘美登’的启动培养基宜采用WPM+6-B A2 mg/L+NAA0.2 mg/L,增殖培养基为WPM+6-B A1 mg/L+NAA 0.05 mg/L+ZT 2 mg/L,生根培养基为1/2 MS+I B A0.1 mg/L+A C0.1%.

在芽的增殖培养中,细胞分裂素的作用至关重要[4-5],因此本试验研究了在含有6-B A的基础上,添加ZT的效果.结果表明,在添加2 mg/L的ZT进行增殖培养,增殖效果明显,植株生长健壮.在生根培养方面,本试验添加了A C,效果也相当显著,根粗壮,生根率也较文献[6]的试验结果明显提高.

[1] 於虹,贺善安,顾姻.我国和世界蓝浆果的发展前景[J].植物资源与环境学报,2001,10（2）：52-55.

[2] 陈正华.木本植物组织培养及其应用[M].北京：高等教育出版社,1986：24-74.

[3] Wolfe DE,EckP,Chin C.Evaluation of seven media for micropropagation of highbush blueberry[J].Hort Science,1983,18（6）：703-705.

[4] 刘树英,张志东,吴林,等.兔眼越桔芽增生诱导培养基及激素的筛选[J].吉林农业大学学报,2002,24（1）：55-57.

[5] 朱忠荣,聂飞.兔眼蓝浆果组织培养研究初报[J].贵州林业科技,2003,31（4）：20-21.

[6] 刘庆忠,赵红军.越桔高效栽培与加工利用[M].北京：中国农业出版社,2003：59-60.