藏灵菇发酵乳对D-半乳糖衰老小鼠脑组织NOS 和NO 的影响①

岳丽红， 程广东* ， 郑 冰， 朱德全， 吴玉德， 徐 岳

(1.佳木斯大学生命科学学院，黑龙江佳木斯154007;2.顺德出入境检验检疫局，广东顺德528303;3.哈尔滨医科大学公共卫生学院，黑龙江哈尔滨150081)

0 引 言

藏灵菇发酵乳是用西藏灵菇(又称西藏雪莲)发酵牛奶而成的传统民间饮品，多年来广受百姓喜爱.近年来，随着对西藏灵菇及其发酵乳的研究日趋深入，西藏灵菇发酵乳的保健作用也得到了研究证明，如调节菌群平衡、治疗消化道疾病、抑制肿瘤、降低血脂血压、延缓衰老等［1～3］，对于其延缓衰老作用的机制，岳丽红等的研究结果表明其可对抗心、肝、肾组织自由基氧化损伤［4～5］.为研究其对脑组织抗氧化作用的影响，本实验给予D -半乳糖(D-gal)衰老小鼠灌服西藏灵菇发酵乳处理，检测其对小鼠脑组织器官指数，脑组织中总一氧化氮合酶(TNOS)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)活力水平及一氧化氮(NO)含量的影响，进一步探讨其对抗脑组织衰老作用的分子机理，为研究西藏灵菇发酵乳的保健作用提供科学依据.

1 材料与方法

1.1 实验动物

昆明种健康小鼠(80 ～90 日龄)24 只，雌雄各半，平均体重(21.78 ±0.73)g，购于佳木斯大学动物实验中心.

1.2 试 剂

藏灵菇由佳木斯大学生命科学学院微生物实验室提供.灵菇发酵乳制备:每天上午将藏灵菇用冷开水洗净，按1 ℅接种量接入伊利纯牛奶中，19±1℃条件下培养24 h，取发酵牛乳备用.

D-gal(恒信化学试剂有限公司)，考马斯亮兰蛋白试剂盒、NO、TNOS、iNOS 测定试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号20101206 -15).

1.3 仪 器

722PC 分光光度计(上海棱光技术有限公司)，组织匀浆机，高灵敏度pH 计(上海精密科学仪器有限公司)，离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)，电子天平等(北京赛多利斯天平有限公司，d=0.1mg).

1.4 动物分组与给药

将24 只雌雄小鼠分别随机分成对照组、衰老组和灵菇发酵乳处理组，分笼饲养，编号标记.饲养温度18 ℃～20 ℃，相对湿度50 % ～60 %，饲喂标准饲料.每日上午8:00 进行给药处理:对照组腹腔注射生理盐水0.65 ml/只，灌胃温开水0.5 ml/只;衰老组按100 mg/kg 体重/只剂量腹腔注射D -gal，灌胃温开水0.5 ml/只;灵菇发酵乳处理组注射同样剂量D-gal，同时灌胃灵菇酸奶0.5 ml/只.连续处理30 d，每5d 称体质量并记录.

1. 5 10%脑组织匀浆的制备

末次给药24h 后，颈动脉放血处死小鼠;迅速按试剂盒说明书的要求在冰板上取脑组织;滤纸吸干残血，称取2 g;用预冷的0.86%生理盐水，在冰水中用组织匀浆机制备脑组织匀浆.测定脑组织蛋白质含量，TNOS，iNOS 酶活力及NO 水平.

1.6 生化指标的检测

考马斯亮蓝法测定蛋白质含量，硝酸还原酶法检测NO 浓度，底物分解法检测TNOS，iNOS 活性，均按测试盒所示方法、步骤进行.

统计学方法 应用SPSS11.5 统计软件进行数据处理.

2 结 果

2.1 藏灵菇发酵乳对体质量与脑器官指数的影响

表1 显示，与对照组相比，衰老组小鼠体质量显著降低(p ＜0.05)，脑指数降低，但差异不显著(p ＞0.05);与衰老组相比，藏灵菇发酵乳组体质量显著增加(p ＜0.05)，脑器官指数增加，差异不显著(p ＞0.05)(表1).

2.2 藏灵菇发酵乳对小鼠脑组织TNOS 活力，iNOS 活力和NO 的影响

表2 显示，与对照组相比，衰老组小鼠的脑组织TNOS，iNOS 活力极显著升高(p ＜0.01)，NO 含量极显著增加(p ＜0.01);与衰老组对比，藏灵菇发酵乳组脑组织TNOS 活力显著降低(p ＜0.05)，iNOS 活力极显著降低(p ＜0.01)，NO 含量极显著降低(p ＜0.01)(表2).

3 讨 论

衰老是一种复杂的生理现象，包括机体内各种生理生化综合反应. 自由基学说是目前公认的，并经过理论和实验证实的最有说服力的衰老学说之一.自由基诱发细胞膜或细胞器膜中不饱和脂肪酸发生过氧化作用，是生物衰老的重要原因之一. 因此，如能减少自由基生成和增强机体抗自由基能力、有效维持二者之间的动态平衡，势必有延缓衰老、促进健康的作用［6］.

表1 对小鼠体质量、脑指数的影响(- x ±s，n = 8)

表2 对小鼠脑组织TNOS，iNOS 及NO 的影响(- x ± s，n = 8)

机体内的NOS 主要有三种存在形式:存在于中枢神经系统的神经元型(nNOS)，分布于内皮细胞的内皮型(eNOS)，存在于哺乳动物有核细胞中的诱导型(iNOS). 在正常生理状态下nNOS 和eNOS 能催化产生少量NO，在炎症过程中内毒素等会使iNOS 增加，在NOS 酶催化下持续产生大量NO.NO 是体内重要的信使分子和神经递质［8～10］，对机体有重要的调节意义;NO 也是一种强氧化剂，过量的NO 会产生过氧亚硝基基团，直接对细胞产生毒性.研究表明，老年动物具较高的NOS 活性，在老年大鼠小脑中eNOS 活性下降而iNOS 活性升高，进而产生更多的NO.iNOS 会损伤神经元，损伤脑组织中负责学习和记忆的区域，直接导致脑功能的衰退.强氧化剂NO 通过破坏生物大分子结构和功能影响机体代谢，因此TNOS 和iNOS 活力及NO 含量，可间接反映脑组织细胞的损伤程度［11］.

本实验表明，D -gal 所致衰老模型小鼠脑组织抗氧化酶活力降低，抗氧化能力降低，强氧化剂NO 产生增多，脑组织氧化损伤严重. 藏灵菇发酵乳能增加致衰老模型小鼠的脑指数，但差异不显著，说明对脑外观形态有一定的影响;藏灵菇发酵乳能降低衰老小鼠脑组织中的TNOS 及iNOS 活性，极显著降低NO 含量，从而减少强氧化剂和脂质过氧化物的产生，提高对自由基的清除能力，抑制和修复由D -半乳糖代谢产生的自由基和有毒物质造成的脑组织细胞氧化的损伤，抑制衰老，提高记忆和反应能力.

［1］ 陶应龙，陈青，张月明，等.食品级藏灵菇培养液对高脂血症患者血脂影响［J］.中国临床营养杂志，2005，10:273 -275.

［2］ 张立娜.灵菇菌乳I 号、II 号对高血压模型大鼠的降压作用的实验研究［D］.东北林业大学硕士论文，2004:13 -25.

［3］ 吴莉莉，白术杰，宗希明，等.西藏灵菇酸奶保健作用的研究［J］.黑龙江医药科学，2011，34(6):21 -22.

［4］ 岳丽红，程广东，王长平，等.西藏灵菇酸奶对衰老小鼠抗氧化作用的研究［J］.佳木斯大学学报，2008，26(3):430 -432.

［5］ 岳丽红，程广东，王长平，等.西藏灵菇酸奶对人工致衰老小鼠肝肾指数的影响［J］. 中国老年学杂志，2009，29(19):2767 -2769.

［6］ 李素云，王立芹，郑稼琳，等. 自由基与衰老的研究进展［J］.中国老年学杂志，2007，27(10):2046 -2047.

［7］ Nathan，C，Xie，Q.W，1994. Nitric Oxide Synthases:Roles，Tolls and Controls. Cell 78，915 –918.

［8］ Laskin，D.L，Pendino，K.J，1995. Macrophages and In?ammatory Mediators in Tissue Injury. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 35:655 –677.

［9］ Kroncke，K. D.，Fehsel，K，Kolb -Bachofen，V，1998. Inducible Nitric Oxide Synthase in Human Diseases. Clin. Exp. Immunol. 113:147 -156.

［10］ Ohshima，H，Bartsch，H.，1994. Chronic Infections and In?ammatory Processes as Cancer Risk Factors:Possible Role of Nitric Oxide in Carcinogenesis. Mutat. Res. 305，253 –264.

［11］ 王怀颖，张秋燕，肖锋，等.一氧化氮与衰老的研究［J］.医学综述，2005，11(4):304 -306.