石蜡包埋组织mi R NA做为肿瘤标志物的研究进展

傅文凡 黄豪达 江泽勇 戴 璐 赵 健

广州医学院附属肿瘤医院肺肿瘤科，广东广州 510095

miRNA是一类长为19～25nt小分子单链RNA，其与靶标基因3'UTR结合，通过降解mRNA或抑制其翻译，从而在转录后对靶标基因的表达水平进行调控。与肿瘤的发生、转移、耐药、预后等密切相关。目前研究miRNA的样本多来源于新鲜组织和细胞。最近发现福尔马林固定石蜡包埋的组织（Formalin-fixed and Paraffin-embedded,FFPE）中miRNA保存比较完整并与新鲜组织中的miRNA高度相关[1]，为miRNA的研究开辟了一个新的途径。石蜡组织miRNA可能是一种理想的肿瘤标志物,该文就该领域的最新进展进行综述。

1 石蜡包埋组织miRNA中存在miRNA

长期以来，医疗和科研机构采用福尔马林固定和石蜡包埋方法保存病理组织。现在全世界已保存有大量的石蜡组织样本，覆盖所有已知的疾病。每个石蜡组织样本都具有特别的价值，关联着大量的病人数据。所以石蜡组织标本是人类对疾病研究宝贵的信息库，尤其是回顾性研究和少见疾病的研究。然而通常mRNA甚至DNA、蛋白都有不同程度的降解。但有研究表明，尽管大分子RNA可能会发生降解，但在一般情况下，小分子RNA是不受石蜡固定影响。此外，已有许多研究证实miRNA受FFPE处理的影响非常小，并且从FFPE样本中提取的microRNA与冷冻组织样本一样，可提供可信的表达谱。甚至保存长达30年的FFPE样本仍可提供可信的microRNA表达谱数据[2]。

2 石蜡包埋组织miRNA的提取

石蜡组织样本可经过异丙醇和乙醇脱蜡后通过trizol法提取总RNA，成本较低。但普通的过柱法效果较差，可能与过柱时小RNA被吸附有关。目前已有多种商品化试剂盒用于从FFPE样本中提取microRNA，例如Ambion公司的RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Kit for FFPE，Qiagen公司的 miRNeasy FFPE Kit，Norgen公司的FFPE RNA Purification Kit等。试剂盒提取简单快速，并且易于富集miRNA，但成本较高。

3 石蜡组织miRNA的检测

对于发现新的miRNA分子通过小分子RNA建库克隆测序是经典方法。首先构建cDNA文库，再将这些cDNA进行克隆、测序，然后生物信息学分析，最后将具有发夹结构的小分子RNA进行Northern杂交以验证。

石蜡组织样本中的已知miRNA检测可以采用miRNA芯片技术，能够发现石蜡组织样本中的miRNA表达谱的差异，利用被筛选出的具有差异的miRNA作进一步研究。目前已有多种类型的miRNA检测芯片可以选用。 但是基因芯片检测方法的重现性和准确性相对较差,一般多用于初筛,对获得的结果通常需要进一步验证。RT-PCR技术是目前最常用的验证miRNA的技术，常见的有Taqman探针法、SYBR Green法、茎环RT-PCR法。也有人采用表面增强拉曼光谱法、磁珠流式检测等。

4 石蜡组织miRNA与新鲜组织miRNA的相关性

目前已经有多项研究表明，石蜡组织中的miRNA与新鲜组织的miRNA有良好的相关性，Xiao Zhang[3]将7对匹配的石蜡包埋组织和新鲜冰冻组织进行miRNA检测，spearman相关指数为0.847～0.948。Jinghuan Li[4]做了类似的研究发现两者的相关系数R20.95，并且认为在总RNA量相当时石蜡中microRNA含量比新鲜组织多。有人比较石蜡和冰冻组织micorRNA及mRNA表达的相关性，发现microRNA高度相关，mRNA则较差。

5 石蜡包埋组织miRNA在肿瘤检测中的应用

由于石蜡组织中miRNA与新鲜组织中的miRNA有良好的相关性，部分学者利用石蜡组织进行了研究。Danit Lebanony[5]利用microRNA做为标志物区分鳞癌和其他非小细胞肺癌，其中hsa-miR-205可区分鳞癌和其他非小细胞肺癌的敏感度96%特异性90%。Nitzan Rosenfeld[6]则通过实验发现石蜡中miRNA不仅保存完好，并且通过miRNA可以区分组织来源。

miRNA与mRNA相比较小、不易降解、缺乏poly A加尾结构，因此受福尔马林固定和石蜡包埋等处理的影响要小。石蜡样本miRNA的特点有利人类更好的利用现有的最大标本库，为探讨肿瘤的发生、发展、预后等等提供又一有力手段。

[1]Wang F,Wang L,Briggs C，et al.DNA degradation test predicts success in whole-genome amplification from diverse clinical samples[J].J Mol Diagn，2007,9(4):441-451.

[2]von Ahlfen S,Missel A,Bendrat K.Determinants of RNA quality from FFPE samples[J].PLoS One，2007，5，2(12):1261.

[3]Zhang X,Chen J,Radcliffe T，et al.An array-based analysis of microRNA expression comparing matched frozen and formalin-fixed paraffin-embedded human tissue samples[J].J Mol Diagn，2008，10(6):513-519.

[4]Li J,Smyth P,Flavin R，et al.Comparison of miRNA expression patterns using total RNA extracted from matched samples of formalin-fixed paraffin-embedded(FFPE)cells and snap frozen cells[J].BMC Biotechnol，2007，29（7）:36.

[5]Lebanony D,Benjamin H,Gilad S，et al.Diagnostic assay based on hsamiR-205 expression distinguishes squamous from nonsquamous nonsmall-cell lung carcinoma[J].J Clin Oncol，2009，27(12):2030-2037.

[6]Rosenfeld N,Aharonov R,Meiri E，et al.MicroRNAs accurately identify cancer tissue origin[J].Nat Biotechnol，2008，26(4):462-469.