影响ELISA检测HBsAg结果的常见因素

吴肖仙 冯淦清

影响ELISA检测HBsAg结果的常见因素

吴肖仙 冯淦清

目的分析酶联免疫吸附试验（ELISA）对表面抗原影响的常见因素，以提高实验结果的准确性。方法使用ELISA法检测HBsAg，对检测步骤进行分析总结，分析可能存在影响检测质量的因素和质控方法。结果血清标本、试剂盒、操作过程、结果数据分析等因素是影响ELISA检测HBsAg结果的主要因素，加强实验过程各环节的质量控制可以提高检测准确度。结论ELISA方法检测HBsAg影响因素较多，对于HBsAg阳性结果应重视复查，以确保检验结果的客观性。

乙肝表面抗原；ELISA方法；影响因素；准确度

酶联免疫吸附试验（ELISA）的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记[1]。ELISA方法操作简单、过程简便，已成为检测乙型肝炎表面抗原（HBsAg）的临床常用手段，但在实际工作中该方法易存在多个影响结果准确性的因素，笔者分析ELISA影响HBsAg检测的常见因素，具体情况汇报如下。

1 血清标本

检验科技术人员在标本检测前应先观察血液样本，部分不符合测试要求的血液样本应重新抽取，如乳糜血、严重黄疸等样本可能因为血清黏稠度高，使抗原反应在一定程度上受到屏蔽，导致假阴性结果的出现。杜绝血液的生理特性，室温下第9天，4～8℃第14天后血液标本将出现溶血现象，具有酶活性的血红蛋白大量出现，导致出现假阳性结果。相同原理，溶血标本应重新抽取。血液抽取后，待血液充分凝固后应及时分离血清，如分离不完全，血清标本中参杂纤维蛋白，结果会出现假阳性。故笔者认为血液标本应及时充分分离，及时检测，如若条件不足未能及时检测，则应当将标本充分分离后置于低温冰箱中。血清标本禁反复冻溶。

2 试剂

不同生物试剂公司的ELISA试剂盒存在敏感度、特异性的差别，检验设备亦要求配套的试剂盒参数，以保证检测质量。试剂盒购买后应置于4℃～6℃环境，每批次新进试剂应在使用前作质量控制，如空白试验、阴阳性对照、临界阳性标本检验等。在检测前要室温中平衡20min后再行测定，该步骤可使反应微孔内的温度迅速达到所需温度，利于后续测定。剩余的试剂应继续保存于4℃～6℃环境，下次检测前应仔细检查试剂是否变质，过期产品不予继续使用。

3 操作因素

ELISA操作过程包括加样、孵育、洗板、显色四个主要步骤。ELISA试剂盒在室温下平衡温度20min后，操作者将事先校准的移液枪进行手工加样，加样量应尽量准确均一，加样过程中移液器应垂直使用，不接触包被板底部，使检测样品均处于加样板的包被区域，操作过程中不允许样品溅出或有气泡产生。如果使用自动加样仪进行上样，为了保证足够的加样量，应选用带有指示剂稀释试剂作为样品加注与否的监测指示。仪器责任人应当定期校准仪器，加强实验重复性的准确度。

加样结束后进行样本孵育，孵育时间对检测结果的准确性有重要影响，根据生理特性，HBsAg孵育温度为37℃，孵育时间根据不同试剂盒有不同的要求，操作应严格按照试剂盒说明书进行。为了最大程度降低实验的边缘效应，HBsAg孵育应采取水浴，并将96孔板用封膜紧密封闭，避免其他污染物对样本造成污染而影响结果。使用的恒温水浴箱温度准确、恒定，每天记录温度，放样本孵育前应先观察温度。

孵育完成后对测试孔板进行洗涤，采用新鲜配制的洗涤液，其配制过程严格按照说明书进行。洗涤液清洗测试板过程中分离结合与未结合的抗原抗体复合物及酶标记物，将孔板内非特异性吸附的蛋白质、血球中酶成分彻底清除，减少干扰，鉴于血清中残留的纤维蛋白丝或洗涤液析出的结晶易使洗板机针小孔全阻塞或半阻塞状态，造成未结合标记酶洗脱不彻底，故笔者建议每日清洗洗板机以确保结果准确性，且每次洗板次数不低于6次。

洗板完成后进行显色操作，使用试剂盒配套的显色液进行显色，显色终止15min内酶标仪读数，酶标仪应避光操作，且操作前应事先预热10min。

4 数据分析

抗原抗体特异性反应时，生成结合物的量与反应物的浓度有关。无论在一定量的抗体中加入不同量的抗原或在一定量的抗原中加入不同量的抗体，均可发现只有在两者分子比例合适时才出现最强的抗原-抗体反应；由于抗原抗体比例不合适而导致假阴性的现象叫钩状效应。ELISA测试过程中由于血清中HBsAg浓度过高、血液黏稠度高、血脂高等容易出现钩状效应而影响结果，故应将检测结果同临床诊断相结合，做出数据的最后判读。

5 讨论

ELISA其操作原理是根据结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析，以了解被测标本中抗体或抗原含量[2-3]。

ELISA方法因操作简单、价格低廉而被广泛运用，但其加样、温度、孵育时间、洗板、显色等因素的影响，导致有一定的假阳性或假阴性结果，给临床结果判读带来一定程度的影响。本文通过对ELISA影响因素分析和总结，针对性进行质量控制，减少或避免人为因素影响，提高结果准确性；对于HBsAg阳性结果应重视复查，以确保检验结果的客观性。

[1] 叶千红,张丽霞.关于标本因素对ELISA检测结果影响的分析[J].中国实验诊断学,2003,7(5)：440-441.

[2] 张蕾,周晶珠,王立.乙型肝炎分子生物学检验方法的应用及质量控制[J].中国现代医生,2009,47(14)：98-99.

[3] 杜艳霞.酶联免疫吸附试验测定操作的体会[J].中国实用医药,2009,4(27)：139-140.

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1673-5846(2013)01-0331-02

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