猪苓和泽泻对肺纤维化大鼠模型血清TGF-β1、TNF-α影响研究

刘本佼，胡海波，周兆山，姜 文

（1.山东中医药大学硕士研究生，山东 济南250014；2.青岛市海慈医疗集团肺病科，山东 青岛266021；3.青岛大学医学院，山东 青岛 266021）

猪苓和泽泻对肺纤维化大鼠模型血清TGF-β1、TNF-α影响研究

刘本佼1，胡海波2，周兆山2，姜 文3

（1.山东中医药大学硕士研究生，山东 济南250014；2.青岛市海慈医疗集团肺病科，山东 青岛266021；3.青岛大学医学院，山东 青岛 266021）

目的：观察猪苓和泽泻对肺纤维化大鼠模型血清TGF-β1、TNF-α的影响。方法：将72只健康雄性W istar大鼠随机分为6组，以支气管内注射博莱霉素的方法制作肺纤维化动物模型。给药后第14天、28天光镜下观察大鼠肺组织病理变化情况，ELISA法检测各组血清中TGF-β1、TNF-α的浓度。结果：各组病理学指标提示大鼠肺组织出现明显的肺间质纤维化，提示动物模型复制成功。通过肺纤维化模型大鼠的病理学改变及血清内TGF-β1、TNF-α浓度比较，各给药组与模型对照组均有显著性差异（P＜0.05）。醋酸泼尼松组的指标改善程度最为显著，猪苓加泽泻组次之，猪苓组及泽泻组最弱。结论：猪苓、泽泻及其合用可降低肺纤维化大鼠血清中TGF-β1、TNF-α浓度，减轻博莱霉素诱发的肺纤维化进程。

肺纤维化；猪苓；泽泻；转化生长因子-β1；肿瘤坏死因子-α

［Abstra a c c t t］Objective：To investigate Zhuling、Zexie and Their Combined Use on the concentrations of TGF-β1and TNF-α of pulmonary fibrosis rats and explore the mechanism of treating pulmonary fibrosis with Zhuling、Zexie and Their Combined Use.Methods：Seventy-two male Wistar rats were divided random ly into six groups，Then rats induced pulmonary fibrosis with bleomycin endotracheally.Half rats were sacrificed on the fourteen day and the left ones were sacrificed on the twenty-eighth day.The rat lung histopathology was examined with HE staining and the concentrations of TGF-β1and TNF-α in the blood serum were examined by Elisa.Results：Changes of pulmonary histopathology in each group were typical，pointed out that Pulmonary Fibrosis Rats Model were successful.The concentrations of TGF-β1and TNF-α in blood serum in each treatment group were significantly decreased than those in model control group（P ＜ 0.05）.Compared comprehensively，prednisone acetate group had the best improvement，then the combination of Zhuling and Zexie group，and Zhuling group and Zexie group worst.Conclusion：The concentrations of TGF-β1and TNF-α in the blood serum of pulmonary fibrosis rats could be significantly reduced by Zhuling、Zexie and Their Combined Use，which may alleviate the degree of bleomycin induced pulmonary fibrosis in rats.

肺间质纤维化是一组以肺间质弥漫性渗出、浸润和纤维化为主要病变的疾病，近年来的研究认为是多种原因导致的肺泡上皮损伤、坏死，成纤维细胞或肌成纤维细胞在病灶部位增殖，引起纤维化的细胞因子增多，最终导致肺泡与肺间质一体化的纤维化［1］。传统治疗以激素和免疫抑制剂为主，长期使用会产生明显不良反应。中医治疗肺纤维化，初有疗效［2，3］。针对西医治疗肺纤维化尚无特效药物及糖皮质激素等治疗所产生的不良反应，导师在治疗肺纤维化时用淡渗利湿药物，以减轻和缓解咳嗽、气短、憋气等症状，取得良好成效。现将导师临床治疗肺纤维化使用频率最高的淡渗利湿药物猪苓、泽泻，借助肺纤维化动物模型进行肺纤维化大鼠模型血清TGF-β1、TNF-α的影响研究，报道如下。

1 材料与方法

动物与分组：清洁级健康雄性wistar大鼠72只（由青岛派特福德白鼠养殖合作社提供），体质量180 ~ 220g，月龄2 ~ 3个月，在室温18 ~ 22℃、空气相对湿度为28%的环境中适应性饲养1周后开始实验。大鼠随机分为正常对照组、模型对照组、醋酸泼尼松组、猪苓组、泽泻组、猪苓加泽泻组，共6组，每组12只。

药物：注射用盐酸博莱霉素由日本化药株式会社生产，配置成溶液（0.5mg/100g加入0.3mL生理盐水）。醋酸泼尼松由上海信谊药厂生产，制成0.4mg/mL溶液。中药水煎液由青岛市海慈医疗集团中药制剂室制备。

试剂及仪器：大鼠TGF-β1ELISA试剂盒、TNF-αELISA试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司生产），Nikon YS100光学显微镜（日本Olympus公司生产）。

动物模型制备：将大鼠以腹腔注射10%水合氯醛（0.2mL/100g）方法麻醉后，模型对照组及治疗组60只大鼠气管内注入博来霉素溶液（0.5mg/100g加入0.3mL生理盐水），并轻揉胸部片刻，使其均匀地分布于肺组织内。正常对照组大鼠注入同体积生理盐水。造模后模型对照组大鼠出现体质量下降、进食减少、活动减少等症状和体征，光镜下显示肺泡组织结构破坏，肺纤维化明显加重，说明大鼠模型制备成功［4］。

给药方法和途径：各组均从造模第2天开始灌胃给药，醋酸泼尼松组给予醋酸泼尼松6mg（/kg·d），猪苓组、泽泻组、猪苓加泽泻组大鼠需生药分别为22g /（kg·d）、33g /（kg·d）、33g /（kg·d）， 模型对照组及正常对照组给予同等量生理盐水。

观察指标与检测方法：给药后第14天、第28天分两批处死大鼠，第1批每组随机取6只大鼠，腹主动脉取血5mL，低温下离心血，取上清液，-20℃保存，待测；摘取右下肺，用中性甲醛固定24h后石蜡包埋、切片，行HE染色。观察所选取肺组织的病理变化情况。用双抗体夹心ELISA法检测大鼠血清中TGF-β1、TNF-α的含量，操作严格按ELISA试剂盒说明书的步骤进行。给药第28天，操作与第14天步骤同。

统计学处理：采用SPSS17.0统计软件进行分析，所得结果以均数±标准差（±s ）表示，配对资料采用t检验，样本的组间比较采用方差分析，数据间关系采用相关分析。P＜0.05作为显著性差异水平。

2 结 果

2.1肺组织病理改变

肉眼观察：对照组大鼠双肺呈粉红色，表面光滑，富有弹性。模型组大鼠双肺颜色暗红，部分边缘点状出血，部分肺叶体积缩小，弹性偏差，药物组处于两者之间。光镜下观察对照组各时期肺组织未见明显病变，模型对照组与治疗组第14天肺泡腔内可见大量的炎性细胞渗出、成纤维细胞增殖、肺泡间隔增厚、肺泡腔缩小；第28天时肺泡间隔增厚、成纤维细胞增多、肺泡腔明显缩小、胶原纤维形成。与文献报道一致［5］，证明造模成功。治疗组与模型对照组病理变化有着同一规律，但肺泡炎、肺纤维化程度都轻于模型对照组。

2.2给药后大鼠血清TGF-β1和TNF-α含量

各组大鼠血清中TGF-β1和TNF-α的含量比较：①给药后第14天、第28天的两个时间段内各组大鼠血清中TGF-β1及TNF-α的含量总体均数不等或不全等（P＜0.05），说明各处理因素对大鼠的血清中TGF-β1及TNF-α的含量有影响；大鼠血清中TGF-β1及TNF-α的含量醋酸泼尼松组、各中药组与模型对照组比较有显著性差异（P＜0.05），醋酸泼尼松组与各中药组比较有显著性差异（P＜0.05），各中药组比较之间无显著差异。②给药后第14天、第28天各组大鼠血清中TGF-β1及TNF-α的含量的前后比较有显著性差异（P＜0.05）。见表1。

表1 第14天各组大鼠血清中TGF-β1和TNF-α含量比较 （±s）

表1 第14天各组大鼠血清中TGF-β1和TNF-α含量比较 （±s）

组别 n TGF-β1 TNF-α第14天 第28天 第14天 第28天正常组 6 10.56±0.64 10.63±0.59 78.71±2.29 67.22±1.76模型对照组 6 38.82±2.54 42.80±3.50 144.02±7.71 156.36±7.39醋酸泼尼松组 6 25.49±2.00 17.10±1.63 93.14±1.76 80.68±1.96猪苓组 6 30.03±1.34 27.96±1.08 104.63±1.26 92.35±2.03泽泻组 6 30.20±1.16 27.75±1.26 103.28±2.19 93.19±1.74猪苓加泽泻组 6 29.18±1.15 22.12±1.54 100.65±1.54 88.63±0.92

2×2析因设计分析及指标的相关分析：猪苓、茯苓及两药交互作用P＜0.05，说明猪苓、茯苓的使用对TGF-β1和TNF-α的影响是有差别的，而且两药之间存在交互作用，数据见表2。TGF-β1和TNF-α呈正相关（r=0.899，P＜0.05）。

表2 TGF-β1和TNF-α的2×2析因设计分析结果 （P值）

3 讨 论

目前中医对肺纤维化的研究正逐步深入，但对其病因病机的认识尚未统一，所用方药虽有一定疗效但很难形成统一的治疗标准。治疗多用益气活血、化瘀祛痰、降逆利水、软坚散结、温补脾肾法［6-8］，但缺乏统一认识。肺纤维化病机多为虚实夹杂，肺失宣降，不能温化、布散脾胃上输之津液，水液内停；肾主纳气，肾气不足，气化失司，水液内停。而本病病程缠绵不愈，淡渗利湿药物能利湿化痰、清痰之源，使水行而血行。猪苓味甘、淡，性平，功效利水渗湿。泽泻味甘、淡，性寒味，功效利水渗湿、泄热通淋。两药均可利湿化痰行水缓解咳、喘、憋等症状。

众多学者认为，肺纤维化是由于各种外源性致病因子和自身体内病理因素引起肺组织炎性损伤，肺泡巨噬细胞（AM）活化，释放TGF-β1、TNF-α、IL-1、IL-8、MCP-1等细胞因子以及其它趋化因子和黏附分子。另促进细胞因子和炎症递质的进一步分泌和表达，形成复杂的细胞因子网络，引起肺泡炎和肺损伤。诸多因子中，TGF-β1［9］、TNF-α［10］在纤维化的发生发展中有重要作用，其中TGF-β1是致纤维化的生长因子，在早期分泌增多，同时启动肺纤维化的过程，形成不可逆性肺损伤。研究表明，在炎症缓解或者组织修复阶段，TGF-β1表达为受损上皮或实质细胞修复，但当其过量表达并引起其他细胞生长因子高表达时可引起纤维化。TNF-α作为重要的炎症介质，促进炎症反应和间质细胞的分化，并可通过与其他细胞因子的相互作用，在某种程度上直接或间接促进细胞外基质的合成。此外，TGF-β1、TNF-α［11］可通过直接或间接作用互相诱导产生，共同促进肺纤维化。

实验结果显示，猪苓组、泽泻组、猪苓加泽泻组、醋酸泼尼松组各时间点肺纤维化程度低于模型对照组，TGF-β1、TNF-α含量低于模型对照组。各给药组与模型对照组均有显著差异。醋酸泼尼松组的指标改善程度最为显著，猪苓加泽泻组次之，猪苓组及泽泻组最弱。提示猪苓、泽泻可以通过下调TGF-β1、TNF-α的表达减轻肺泡炎程度，猪苓、泽泻合用效果优于单用，从而抑制炎症反应，减轻博来霉素对肺组织的致纤维化作用，从而延缓并减轻肺间质纤维化的发生和发展。

［1］林庆艳，孙中关，杨俊玲.细胞因子在肺纤维化发生发展中的作用［J］.中国现代实用医学杂志，2006，12（5）：37-40.

［2］赵永胜，阴素萍.益肺活血汤治疗肺间质纤维化2l例［J］.陕西中医，2008，29（4）：391-392.

［3］张晓梅，孙雪松，姜良铎，等.芪红汤治疗特发性肺间质纤维化的临床研究［J］.北京中医药大学学报（中医临床版），2007，14（1）：9-11.

［4］Henm es AR，Zaiman A，Champion HC.PDE5A inhibition atlenuates leomycin-induced pulmonary fibrosis and RhoA／Rho kinase activation［J］.Am J Physiol Lung Cell M ol Physiol，2008，294（1）：24-33.

［5］Kimua T，IshiiY，M orishma Y，et al.T reatment w ith alphagalacto aylcram ide the developm ent o f blem ycin-induced pulmonary fibrosis ［J］.J Immunol，2004，172（9）：5782-5789.

［6］张立山，戴雁彦，任传云.武维屏教授治疗肺纤维化十法［J］.中国中医药信息杂志，2008，15（4）：94-95.

［7］艾敏，陈新.周平安教授补气活血法治疗肺间质纤维化经验介绍［J］.新中医，2009，41（8）：14-15.

［8］郭素芳.中医药疗法在特发性肺纤维化治疗中的应用［J］.中国中医药信息杂志，2008，15（2）：90-91.

［9］郝长付，姚武，吴逸明.TGF-β1在实验性矽肺大鼠肺组织中的表达及其意义［J］.医药论坛杂志，2006，27（7）：42.

［10］任平香，王献化，蒋建姝，等.肿瘤坏死因子-α与肺纤维化［J］.中国煤炭工业医学杂志，2007（11）：62.

［11］林庆艳，孙中关，杨俊玲.细胞因子在肺纤维化发生发展中的作用［J］.中国现代实用医学杂志，2006，12（5）：37-40.

d s s］Pulmonary Fibrosis；Zhuling；Zexie；TGF-β1；TNF-α

R256.156.34

B

1004-2814(2013）04-236-03

周兆山

2013-01-08