树鼩进化分类地位的分子证据

许 凌, 范 宇, 蒋学龙, 姚永刚

1. 中国科学院昆明动物研究所，中国科学院与云南省动物模型与人类疾病机理重点实验室， 云南 昆明 650223；

2. 中国科学院昆明动物研究所，遗传资源与进化国家重点实验室，云南 昆明 650223；

3. 中国科学院大学，北京 100039；

4. 中国科学院昆明动物研究所，中国科学院灵长类研究中心，云南 昆明 650223；

5. 中国科学院昆明动物研究所，中国科学院树鼩饲养繁殖基地，云南 昆明 650223

树鼩(tree shrews) 隶属于攀鼩目(Scandentia)，为 外形类似于松鼠的一类小型哺乳动物，体重≤320 g,广泛分布于南亚、东南亚及我国南部 (Corbet & Hill,1992; Helgen，2005)。其中北树鼩 (Tupaia belangeri；亦称中缅树鼩)是攀鼩目在我国的唯一代表，头体长 140～230 mm，成年体重 80～200 g(Wang，1987)，3～4月龄性成熟，怀孕期 40～45 d，哺乳期～35 d，一胎产1～6只，通常产3～4只(Peng et al，1991)。虽然人类对树鼩的研究已有～200年历史，但直到20世纪80年代树鼩作为模型动物在生物学方面的研究才引起较多的关注(Sargis,2004)。树鼩在生理解剖、神经发育、肝炎病毒感染特性及心理应激模式等方面与灵长类，甚至人类高度相似 (Xu et al，2013)，且具有体型小、饲养成本低及群体扩繁快等特点，被广泛应用于人类医学实验研究的诸多领域，尤其是在人类病毒性肝炎模型的研究方面具有独特的疾病模型优势 (Jiao et al，2009; Shen et al，2011)。另外，树鼩拥有哺乳动物中最大的脑-体重比，是研究脑功能和神经退行性疾病的理想模型(Peng et al，1991; Previc, 2009)。如今，作为一类具有潜在应用价值的新型模式动物，树鼩已越来越多地引起人们的关注。

在树鼩被应用于生物医学实验研究诸多领域的同时，对于树鼩自身所处的系统进化分类地位的研究也未曾离开人们的视线。由于根据形态学数据与分子证据得到的结论之间存在显著差异，导致其系统分类地位一直受到争议(Shoshani et al，1996;Olson et al，2004)。为了解决这个问题，研究者纷纷通过利用更有代表性的DNA长片段(甚至是树鼩全基因组序列)，建立更多独立的数据集合及结合更多种计算方法等手段来阐明树鼩与其他物种的亲缘关系。这些方法的建立和手段的利用丰富了分子系统发育进化理论的发展，也为各物种分类提供了有效的分子证据。本文通过回顾树鼩的分类地位、探讨各国学者通过不同分子证据，主要是线粒体基因序列和核基因序列数据，以增进人们对树鼩的系统进化分类地位的认知，并全面认识树鼩的进化地位。

1 树鼩的传统分类地位

1.1 树鼩归类于攀鼩目

1780年，一只树鼩被误认为是松鼠而被准确描述并附绘图，且直到 40年后才作为哺乳动物的一个独立类群而被认识，并被归入食虫类，如：最早被定名的普通树鼩(Tupaia glis)即是作为鼩鼱属的一个物种被命名为Sores glis Diard, 1820。1821年，Raffles在描记两新物种的同时以新种 Tupaia ferruglinea (Tupaia glis同物异名)为模式种建立了树鼩属(Tupaia)(Olson et al，2005)。此后 Gray 于1825年以树鼩属为模式属建立树鼩亚科 (Tupaiinae)并置于鼹科 (Talpidae)，当然此时的鼹科包含了除象鼩(macroscelids)以外的所有现生食虫类动物(Gray，1825)。随着研究的深入，特别是解剖学研究的进展，19世纪中叶发现原有食虫类动物存在盲肠有(树鼩、象鼩)或无(其他食虫类)的区分，这一发现在进化与分类上的意义部分为 21世纪初分子系统学研究所证实(Murphy et al，2001)。然而进一步的形态学研究表明树鼩科动物与原始的狐猴类动物在颅骨和生殖系统方面具有相似性，Carlsson(1922)首次提出树鼩与灵长目之间存在着密切关系，其依据是两者在颅骨、牙齿、肌群、胃肠道及生殖系统等方面有很多共同特征，但是这些特征在象鼩或其他食虫类动物中没有出现，因而将树鼩科归入灵长类原猴亚目(Prosimii)。这一假说随后得到基于树鼩头骨、大脑、颅后骨等详细解剖观察数据的支持(Le Gros, 1924)，并且古生物学、分子与形态研究等结果也揭示树鼩被归入灵长目动物(Novacek,1992; Simpson, 1945)。然而，作为一个独立的类群，树鼩并无现存的近亲，而被认为最好建立一个目级分类单元——攀鼩目(Scandentia)(Butler, 1972;Luckett, 1980)。Zeller (1986)根据树鼩头骨形态发生的研究结果(即：树鼩与灵长类间无联系)强烈支持树鼩科应作为一个独立的目。近年来在哺乳动物高级分类阶元的研究中，分子系统发育研究结果揭示树鼩与皮翼类、灵长类及“食虫类”明显形成了一个自然的独立类群(Murphy et al，2001)。

1.2 争论不休的攀鼩目

在明确攀鼩目为一独立分类单元后，对于攀鼩目在哺乳动物中的系统关系，即其究竟是灵长总目中灵长动物分支成员还是啮齿动物分支成员，仍有不少争议。总体而言大致有以下三种观点：(1) 将皮翼目(Dermoptera)和攀鼩目归为巽他兽类(Sundatheria)的一支而成为灵长目的旁系群(Madsen et al，2001; Murphy et al, 2001)；(2) 攀鼩目与皮翼目动物和灵长目动物共同组成了灵长动物(Euarchonta)，更进一步将灵长目及皮翼目归为灵长形类(Primatomorpha)而成为攀鼩目的旁系群(Janečka et al, 2007)；(3) 认为攀鼩目的树鼩是兔形目(Lagomorpha)的近缘旁系群 (Arnason et al,2002)，再加上啮齿目动物一同形成了灵长总目啮齿动物(Glires)分支。这样的争论时至今日，仍然没有得到统一的结论。

目前，攀鼩目被分为2科：白昼活动的树鼩科(Tapaiidae)和黄昏或者晚上活动的笔尾树鼩科(Ptilocercidae)；5属。树鼩科由4属组成，分别是南印树鼩属(Anathana)、细尾树鼩属(Dendrogale)、树鼩属(Tupaia)及菲律宾树鼩属(Urogale)，而笔尾树鼩科只有一单型属——笔尾树鼩属(Ptilocercus)；20种及 44亚种，分布于南亚、东南亚及中国南部，其中最大属为树鼩属(Tupaia)，有 15种 40亚种(Helgen， 2005)。然而这样的分类也存在争议，Davis认为这样的划分不可行，因为细尾树鼩属从形态学角度介于笔尾树鼩和其他树鼩之间(Davis, 1938;Olson et al, 2005)。时至今日，对于攀鼩目动物内部的系统进化关系亦还没有一致结论。

北树鼩 (Tupaia belangeri)为攀鼩目在我国的唯一代表，分布于克拉地峡(Isthmus of Kra)以北地区，包括泰国、柬埔寨、老挝、越南、缅甸、孟加拉、印度东北部与中国南部。在亚种分类上，Wang(1987) 基于外部毛色化及形态特征比较将中国现生树鼩分为6个亚种，即：滇西亚种(T. b. chinensis)、高黎贡山亚种(T. b. gaoligongensis)、海南亚种(T. b.modesta)、越北亚种 (T. b. tonquinia)、滇南亚种(T. b.yunalis)及瑶山亚种 (T. b. yaoshanensis)。尽管Corbet & Hill (1992)承认了其中的4个亚种，但认为chinensis 和modesta为同物异名。Helgen (2005)则将北树鼩仅分为2个亚种：T. b. belangeri和T. b.chinensis，当然，他也指出需要对该物种的种内地理分化进行仔细研究。

2 线粒体DNA数据揭示树鼩与啮齿目动物是“近亲”

线粒体 DNA (mtDNA)由于具有母系遗传及缺乏重组的特点，被广泛用于研究物种系统发生关系(Arnason et al, 1999; Derchia et al, 1996; Krettek et al,1995; Rasmussen et al, 1998; Zardoya & Meyer,1997)。树鼩线粒体全基因组最早由德国灵长类研究中心在2000年测序完成 (Schmitz et al, 2000)，全长16 754个碱基，与已知的哺乳动物线粒体基因组组成基本类似。有趣的是，树鼩线粒体基因组中的COXII基因和tRNA-Lys紧密相连，该特点与啮齿目动物几内亚猪(Cavia porcellus)相同，但不同于其他哺乳动物。

Schmitz et al (2000)利用树鼩线粒体DNA重链的 12个蛋白编码序列与皮翼目动物牙买加果蝠(Artibeus jamaicensis)，啮齿目动物小家鼠(Mus musculus)、褐家鼠(Rattus norvegicus)，兔形目动物欧兔(Oryctolagus cuniculus)、天竺鼠(Cavia porcellus)，偶蹄动物马 (Equus caballus)、欧洲野牛(Bos taurus)以及7个具有代表性的类人猿亚目动物的序列进行系统树构建，并以负鼠(Didelphis virginiana)作为外群，通过不同的算法，最终认为树鼩是兔形目动物的近缘旁系群这个结论有较高的可信度。Lin et al (2002) 在研究兔形目和啮齿目动物mtDNA基因组的系统发育关系过程中，也发现树鼩与兔形目存在很强的近缘关系，攀鼩目是兔形目的近缘旁系群。但是这样的划分也存在不合理之处，因为这类比较没有包括灵长目的另一类近缘动物——皮翼目动物 (Schmitz et al, 2000)。于是，Arnason et al (2002)通过对 60个真兽亚纲动物的mtDNA基因组全序列在核苷酸和蛋白水平上进行的系统进化发育关系分析，发现在有皮翼目动物猫猴(Cynocephalus variegatus)的情况下，树鼩与兔形目动物的亲缘关系依然要近于灵长动物。另外，线粒体编码的蛋白共有13个，但是Schmitz et al (2000)的研究中，没有使用由轻链编码的蛋白ND6，这是由于 ND6蛋白在氨基酸组成上与其他线粒体编码的蛋白相比变异度非常大(Waddell & Shelley,2003)，很少被用于系统进化分析。有趣的是，利用这样变异度大的蛋白进行系统发育进化分析，显示树鼩与啮齿目动物的亲缘关系依然要更近于灵长动物 (Waddell & Shelley, 2003)。与该结果一致的是， Hudelot et al (2003) 利用数据库中69个物种的线粒体全基因组中的tRNA和rRNA序列，针对RNA替换速率的特点 (作为DNA-氨基酸的中间态的 RNA，其替换速率取决于序列中碱基的热稳定性)，选用似然法中的两种进化模型模拟线粒体RNA序列中的不同部分(对于配对位点选用配对位点模型；对于非配对位点选用单位点模型)，再加上贝叶斯算法（Bayesian algorithm）和马尔卡夫蒙地卡罗算法（Markov Monte Carlo method， MCMC）以获得最可能的系统进化发育树和后验概率支系，结果也支持树鼩与兔形目动物的亲缘关系更加接近(Jow et al, 2002; Hudelot et al, 2003)。由此看来，mtDNA数据分析的结果一致认为树鼩是啮齿目动物的近缘旁系群。

在前期研究中，我们测定了 3只中国树鼩(Tupaia belangeri chinensis)和 1 只马来猫猴(Galeopterus variegatu)的mtDNA全基因组序列。结合前人报道的灵长动物和其他相关物种的 mtDNA基因组数据，我们对攀鼩目、皮翼目和灵长目中代表性物种之间的亲缘关系进行了重构。结果显示，中国树鼩和马来猫猴mtDNA基因组的基因组织和结构形式与其他哺乳动物的mtDNA基因组相似。依据 12个线粒体蛋白编码基因构建的系统发育树显示攀鼩目动物和兔形目动物之间的关系更加密切，而皮翼目动物和灵长类动物组成姐妹群。该结果与前人基于mtDNA数据分析的结果相吻合，基于文献及我们mtDNA基因组研究的结果表明，树鼩同灵长类动物的亲缘关系并没有如我们想像的那么接近(Xu et al, 2012)。

树鼩科内部不同种属间的系统发育地位也是一个有趣的问题。Olson et al (2005)利用具有高保守性的线粒体12S rRNA序列片段，分析了来自多个地域的已报道树鼩物种的系统发育关系，认为笔尾树鼩属是其他树鼩属的姐妹支系，较早与其他属发生分歧；接着是婆罗洲树鼩与其他树鼩科动物发生分歧；但是仍然未分辨出树鼩科内其他属之间的种系关系。

3 核基因数据分析

由于mtDNA数据的局限性，来自核基因的数据被较多地应用于树鼩的分类地位探讨。基于单个核基因片段或多个核基因数据集，目前已有较多研究，然而这些研究揭示的结果不尽相同。

3.1 树鼩是皮翼目动物猫猴的近缘旁系群

Madsen et al (2001)通过分析26种有胎盘动物长度分别是5 708 bp和 2 947 bp的DNA拼接片段，否定了树鼩与皮翼目动物和灵长目动物共同形成灵长动物这一假说。但这两个DNA数据分析的结果不一致：5 708 bp的DNA数据支持树鼩与皮翼目动物共同形成近缘旁系群，而2 947 bp数据显示树鼩作为整个灵长总目动物(包括灵长动物和啮齿动物)的外群更为合适。在同一时期，Murphy et al(2001)利用16.4 kb的DNA片段(包括19个核基因和 3个线粒体基因)，通过贝叶斯算法和最大似然法对42种有胎盘动物和2种有袋动物 (作为外群)进行了系统发育关系重建，结果支持树鼩是皮翼目动物的近缘旁系群。另外，Amrine-Madsen et al(2003)采用载脂蛋白 B (APOB)基因 (共 26个外显子，1 342 bp)，对63个属于真兽亚纲的动物进行了系统发育关系的分析，并将 APOB基因片段同Murphy et al (2001)研究中16.4 kb的DNA片段进行拼接串联，通过贝叶斯方法和最大似然法进行分析，结果支持树鼩与皮翼目动物的亲缘关系更加接近，而单独的APOB基因则支持树鼩与兔形目和啮齿目动物共同组成的啮齿动物分支。灵长总目动物中的染色体图染(chromosome painting)和细胞核型比较分析证实，树鼩的核型相对于人类而言具有很高的衍生性(Müller et al, 1999)。Nie et al (2008)通过染色体图染的方法建立了人和皮翼目动物猫猴的全基因组染色体比较图谱，在确定了 44个猫猴和人同源性染色体后，通过与已发表染色体图谱相比较，G带核型(G-banded karyotype)分析认为树鼩与猫猴 (Galeopterus variegatu)共享有一个独特的衍生型联接——HSA2q/21，该人类结合片段联接(human syntenic segment association，HSA)提示树鼩与猫猴是姐妹支系，并且这个联接的产生来自于二者相似的常染色体。染色体图染结果支持树鼩是皮翼目动物猫猴的近缘旁系群 (Nie et al, 2008)。

3.2 树鼩与皮翼目动物和灵长目动物共同组成灵长动物

部分报道的核DNA研究结果显示树鼩与猫猴亲缘关系较远，猫猴与灵长目动物的亲缘关系更加接近，三者一同形成灵长动物分支。Janečka et al(2007)通过两种独立的方式对灵长总目的进化关系进行了分析：首先对 21个灵长总目动物的基因组中罕见的外显子插入缺失(共有197 522个基因外显子)进行了多物种序列比对，其中，有3个特异性缺失支持灵长动物的单系起源，但没有任何的特异性缺失将树鼩与猫猴联系在一起，反而猫猴和灵长目共享了7个特异性缺失，树鼩与灵长目动物只共享了一个。其次，利用～14 kb共19个核基因拼接片段进行贝叶斯和最大似然法分析，构建的系统发育树支持与灵长目动物最近缘的动物是皮翼目动物猫猴，该结果与 mtDNA分析结果一致。另外，Killian et al (2001)利用甘露糖6磷酸和胰岛素样生长因子Ⅱ序列进行分析的结果也支持树鼩与皮翼目动物和灵长目动物一同形成灵长动物分支，但皮翼目动物与灵长目动物亲缘关系更近。

3.3 树鼩是啮齿动物的近缘旁系群

目前也有核基因数据结果与线粒体数据结果一致的报道，显示树鼩属于啮齿动物。Bailey et al(1992)分析了11个灵长目动物和树鼩等的ε-球蛋白基因(ε-globin genes)，结果显示树鼩与兔形目的亲缘关系更加接近。另外，Porter et al (1996)比较了包括树鼩在内的 27个物种 von Willebrand因子(von Willebrand factor, vWF)第28号外显子序列变异，基于最大简约法分析得到的系统发育树支持树鼩是啮齿动物的近缘旁系群。短分散重复序列(short interspersed elements, SINEs)来源于小 RNA 的复位，通过插入方式存在于所有的真核细胞基因组中，因为SINE具有在基因组中拷贝数高及在不同物种中序列的复杂性不同等特点，使得SINE成为有效的系统发育分子标记(Kriegs et al, 2007)。SINE由7SL RNA演化而来，并且在所有的灵长动物中都有不同的衍生形式，由单体二聚化形成二聚体(Kriegs et al, 2007)。Alu二聚化形式仅在灵长目动物中出现，B1型在啮齿目动物出现，树鼩中出现的Tu型单体 (Tu type-m)序列则是Alu和B1型两种序列的嵌合型 (Nishihara et al, 2002)。通过基因组搜索发现人和树鼩共享5个独立的反转录插入，而树鼩与褐家鼠(Rattus norvegicus)、小家鼠(Mus musculus)和欧兔(Oryctolagus cuniculus)共享了 14个独立的反转录插入，这提示树鼩与啮齿动物共享更多相同的独特反转录插入(Kriegs et al, 2007)。但由于Kriegs et al (2007)的研究缺少其他兔形目动物和猫猴的数据，对树鼩具体的进化地位未能提供更多的信息。Hallström & Janke (2010) 应用最大似然法对31个哺乳动物的3 364 个同源基因进行构树，结果显示树鼩与啮齿动物亲缘关系更近，但 pSH(Shimodaira-Hasegawa probabilities)检测在一定程度上支持树鼩与灵长目更近，而邻接网络分析(neighbor-net)无法确定树鼩与灵长目和啮齿动物的关系。Meredith et al (2011)基于26个基因采用最大似然法和贝叶斯法构建系统发育树，发现树鼩与啮齿动物的亲缘关系更近。

3.4 全基因组数据揭示树鼩是灵长类近亲

Lindblad-Toh et al (2011)利用美国Broad研究所公布的2X的不完整的树鼩基因组数据重构了29个哺乳动物的系统发育关系，显示树鼩是最接近灵长类的动物。在近期的一项研究中，Song et al (2012)利用447个核基因重构37个物种的系统发育树，并联合物种树的最大假似然评估方法(maximum pseudolikelihood estimation of the species tree，MP-EST)和物种树的平均等级聚集评估方法(species tree estimation using average ranks of coalescence，STAR)对系统发育树进行更精确评估，显示树鼩与灵长类的亲缘关系最为接近。昆明动物研究所利用二代测序技术高质量完成了一只中缅树鼩的全基因组测序，总覆盖度高达79X。利用树鼩等15个物种(其中包括6种灵长类动物、2种啮齿类动物及1种兔形类动物)的基因组数据，提取了2 117个单拷贝基因重构系统发育树。结果表明，无论是用 CDS序列还是蛋白质序列构树，树鼩均与灵长类聚在一起，与灵长类亲缘最近 (Fan et al,2013)。基于这些基因估算的分歧时间显示树鼩与灵长类分歧时间大约发生在 90.9 百万年前(million years ago，mya), 而啮齿类与与灵长分歧时间大约发生在96.4百万年前 (Fan et al, 2013)。

尽管现有的树鼩的全基因组数据显示树鼩与灵长目动物的亲缘关系最为接近，但由于皮翼目动物猫猴全基因组序列的缺乏，因此我们无法更加细分树鼩在灵长动物分支中的地位。

4 结语

综上所述，不同的研究分别利用线粒体基因序列和核基因序列数据进行系统进化分析，显示的树鼩进化地位有很大的不同。线粒体数据倾向于树鼩作为啮齿类动物的近缘旁系群，与兔形目动物关系最为接近(Adkins & Honeycutt, 1991; Arnason et al,1999; Schmitz et al, 2000; Xu et al, 2012)。核基因数据则倾向于支持树鼩归入灵长动物分支，但具体类群的聚类关系不同，有人认为树鼩是皮翼目动物猫猴的近缘旁系群(Madsen et al, 2001; Murphy et al,2001)，有人支持三者都属于灵长动物分支 (Janečka et al, 2007; Killian et al, 2001)，也有人认为树鼩与啮齿动物的亲缘关系较近 (Allard et al, 1996; Bailey et al, 1992; Porter et al, 1996)。全基因组数据显示树鼩与灵长目动物接近(Fan et al, 2013, Song et al,2012)，但其精确定位有待于猫猴的全基因组序列来比较。

虽然分子遗传和形态证据的矛盾及分子遗传证据内部的矛盾导致最终呈现的树鼩分类地位的差异，但多数研究不排除树鼩与灵长类的亲缘关系。事实上，由于树鼩长期被认为是介于灵长类古老类型和现代灵长类之间的中间类型，树鼩在形态及分子遗传方面具有古老特征与更为进化的特征共存的特点。一些遗传特征保持与兔形目一致，提示它们来源于共同的祖先；随后攀鼩目与灵长目的祖先进化出部分相同的形态特征(Allard et al, 1996; Liu et al, 2001; Miyamoto, 1996)。因此，不论是用线粒体序列和核基因序列对树鼩进化分类地位的确认都是片面的。单独分析线粒体数据，更多体现的是树鼩与兔形目相似的一面，而选择性分析不同的核基因或者一部分核基因片段也只是抓取到了树鼩进化过程中的某一个或某一时期的特征。因此，或许正如 Janečka et al (2007)和 Nie et al (2008)所指出的：对灵长目动物的形态学和基因组进化的正确认识源于对其旁系群 (猫猴、树鼩)的正确认识。要想获得对树鼩进化地位的全面认识，测定树鼩进化过程中近缘旁系群物种的全基因组，应当是首先需要考虑的问题。

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