猪食道口线虫核糖体18S部分序列的PCR扩增及分析

程 田 舒 丽 林瑞庆

（1.华南农业大学兽医学院，广州 510642；

2.四川省富顺县永年镇兽医站，富顺 643200）

猪食道口线虫核糖体18S部分序列的PCR扩增及分析

程 田1舒 丽2林瑞庆1

（1.华南农业大学兽医学院，广州 510642；

2.四川省富顺县永年镇兽医站，富顺 643200）

以保守引物扩增猪体的食道口线虫rDNA 18S的部分序列并进行测序和分析。实验获得18S部分有效序列大小为894 bp，序列非常保守，两个虫种之间不存在差异，仅发现四棘食道口线虫样品存在一个变异位点，与其他线虫相应序列比较有不同程度的差异。本研究首次报道了猪食道口线虫的18S序列，为食道口线虫的分子生物学的进一步研究奠定了基础。

食道口线虫 rDNA PCR 序列分析

猪食道口线虫属于圆形目（Strongyloidea）食道口属（Oesophagostomum）。有齿食道口线虫（Oesophagostomum dentatum）和四棘食道口线虫（Oesophagostomum quadrispinulatum）是感染猪的两个常见种，因常寄生于猪的肠壁形成结节状的病变，故有“结节虫”之称[1]。利用现代分子生物学技术，寻找猪食道口线虫与其他寄生虫之间及属内不同种之间的分子分类的标记，在猪食道口线虫病的流行病学和疾病监控与防治方面都具体非常重要的意义。

大部分生物细胞核糖体DNA（rDNA）从5′到3′包括非转录间隔区DNA、外转录间隔区DNA、18S rRNA基因、两侧具有内转录间隔区（ITS）DNA的5.8SrDNA基因和28SrRNA基因的重复基因单位[2]。核糖体各部分序列均有应用于寄生虫的分子分类学和分子遗传学研究中，但目前猪食道口线虫18S序列的分析未见报道。有鉴于此，本研究以我国不同地区猪的食道口线虫作为研究对象，PCR扩增其18S rDNA基因部分序列，并进行序列测定和分析，为食道口线虫的分子生物学的进一步研究奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 虫体样品

虫体样品来自中国湖南怀化（样品编号：OspHN1、OspHN2、OspHN3）、广东阳江（样品编号：OspYJ1）、重庆渝北（样品编号：OspYB1）、重庆永川（样品编号：OspYC1），形态学初步鉴定为食道口线虫，后经特异PCR分子鉴定定种[3]。

1.2 主要试剂

DNA提取试剂盒WizardTMDNA Clean-Up System、pGEM-T Easy载体试剂盒均为Promega产品；Ex Taq酶，DL-2000 DNA Marker均为TaKaRa产品；DNA胶回收试剂盒为上海生工产品；感受态细胞DH5α为兽医寄生虫学研究室保存。

1.3 虫体DNA提取

从70%酒精保存液中取出单个虫体，用双蒸水反复吹打冲洗2次后，再用纯净水反复冲洗2～3次，置于新的1.5 ml 的eppendorf管中，用灭菌微型剪刀将虫体组织剪碎，然后在纯净水中浸泡20 min。吸干水分，按照DNA 提取试剂说明书进行提取，将提取的DNA置于－20℃冰箱保存备用。

1.4 18S rDNA序列片段PCR扩增

根据GenBank里猪蛔虫、秀丽线虫、犬恶心丝虫等的核糖体18S序列，设计一对保守引物（18SF：GAGGAGGTAGTGACGAAT和18SR：GGACATCTAAGGGCATC），引物由上海生工生物技术有限公司合成。PCR扩增体系为25 μl，PCR反应条件为先94℃预变性5 min，后94℃变性30 sec，46.5℃退火30 sec，72℃延伸30 s，进行30个循环，最后72℃延伸5 min。同时设不加DNA模板的阴性对照。扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳，于紫外透射仪上观察并记录结果。

1.5 测序

将PCR产物送深圳华大基因公司测序，然后进行序列比较和分析。

2 结果

2.1 18S rDNA片段的PCR扩增

特异PCR分子鉴定表明湖南怀化样品OspHN1、OspHN2和广东阳江OspYJ1为有齿食道口线虫，湖南怀化样品OspHN3、重庆渝北样品OspYB1和重庆永川OspYC1为四棘食道口线虫。以18SF和18SR作为引物进行PCR扩增，PCR产物于1 %琼脂糖凝胶进行电泳，可见约1000 bp的条带，详见图1，与预期目的片段大小一致。

图1 食道口线虫18S rDNA片段的PCR扩增电泳图

2.2 测序和分析

测序获得食道口线虫18S rDNA部分基因有效序列大小为894 bp，序列非常保守，两个虫种之间不存在差异，仅发现1个四棘食道口线虫样品存在一个A/C变异位点。详见下面顺序。

AGACCATTCCTATGGAACGGTCATTTCAATGAGTTGATCATAAACCTTTTTTCGAGGATCAAGTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCACT AGTGTAAATCGTCATTGCTGCGGTTAAAAAGCTCGTAGTTGGATCTGAGTCACATGC AGTGGTTCGCCTTTGGCGTTAATCGCTGTTGTGACTATTTGCTGGTTTTCTACTAAG GTTTCGGCCTTTGTAGTGGCTAGCGAGTTTACTTTGAATAAATTAGAGTGCTCAGAACAGGCGTTTGCCTGAATGCTCGATCATGGAATAATAAAAGAGGACTTCGGTTCTATTTATTGGTTCAGGAACTGAAATAATGGTTAAGAGGGACAATTCGGGGGCATTCGTATC CCTGCGCGAGAGGTGAAATTCGTGGACCGCAGGGGGACGCCCTAAAGCGAAAGCATT TGCCAAGAATGTCTTCATTAATCAAGAACGAAAGTCAGAGGTTCGAAGGCGATTAGA TACCGCCCTAGTTCTGACCGTAAACTATGCCATCTAGCGATCCGATGGGGTATTGTTGCCTTGTCGAGGAGCTTCCCGGAAACGAAAGTCTTTCGGTTCCTGGGGTAGTATGGT TGCAAAGCTGAAACTTAAAGAAATTGACGGAATGGCACCACCAGGAGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGAAAACTCACCCGGCCCGGACACCGTAAGGATTGACAGATTGAAA/CGCTCTTTCTCGATTTGGTGGTTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGT TGGTGGAGCGATTTGTCTGGTTTATTCCGATAACGAGCGAGACTCTAGCCTGCTAAA TAGTGGCTGGATTTTTACGTCCAGTCTACTTCTTAGAGGGATAAG

将本试验中所测得的猪食道口线虫的18S rDNA序列与GenBank中收录的同为圆形目夏伯特科的绵羊夏伯特线虫、冠尾科有齿冠尾线虫、网尾科丝状网尾线虫、蛔目的猪蛔虫、杆形目的秀丽隐杆线虫、旋尾目的犬恶心丝虫的相应序列进行比较分析，结果详见表1。

表1 猪食道口线虫基因序列的相似性比较

3 讨论

编码核糖体RNA的基因是由一些高度重复序列组成的多基因家族。rRNA基因以串联重复形式存在于染色体上。由于rRNA基因中包含了进化速度不等的编码区、非编码转录区和非转录区，可以选择其中保守程度不同的片段作为分子标记来鉴定生物体不同种、亚种和地理株，以及研究其系统进化关系，因此基于寄生虫核糖体序列的遗传变异多态性特征已建立了许多寄生虫分子诊断方法[4-7]。18S rDNA序列较长，并存在一些多变区，比较适合作为科级水平以上的分类依据。本研究首次报道了猪有齿食道口线虫和四棘食道口线虫的18S rDNA的部分序列，结果显示序列非常保守，两个虫种间不存在差异，与其他线虫相应序列比较显示科以内非常保守，同目不同科有一定的差异，不同目的则差异较为明显，表明18S rDNA可用于较高分类阶元寄生虫的遗传变异和进化分析。

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