壳聚糖/明胶磁性微球的反相悬浮乳液包埋法制备研究

宋宏新， 李 韵， 薛海燕， 贺宝元

(1.陕西科技大学 生命科学与工程学院， 陕西 西安 710021； 2.陕西科技大学 资源与环境学院， 陕西 西安 710021)

0 引言

磁性微球是通过将磁性粒子与有机高分子结合，形成具有一定磁性及特殊结构的复合微球.用它来进行目标物分离,具有操作简单、高效快速、可重复使用、保持靶物质生物活性等特点.磁性微球分离技术广泛用于医学抗癌导向、生物物质分离及食品检测等，是生物分离技术的一次革命，有力地推动了医学和生物学研究的发展[1-3].

磁性微球的制备方法主要有包埋法、单体聚合法、共沉淀法和化学沉淀法等[4].磁性微球的制备一直是一个技术难点，高质量磁性微球主要依靠进口国外高价产品，大大限制了磁性微球在国内生物医学研究领域的应用[5].本研究在综合比较各种制备方法的基础上，研究了制备高质量磁性微球的优化工艺方法.

1 实验材料与方法

1.1 试剂及仪器

试剂：液体石蜡(化学纯)，相对密度0.835～0.855;Span-80(化学纯)皂化价145～185；壳聚糖(BETTER)，脱乙酰度95.7%，分子量775 Kda，等电点为4.7；明胶(西安舟鼎国生物技术有限责任公司)，约225水华，平均分子量50,000，每100 g有100～150 mmol羧基基团，含水量13.7%，等电点为4.7～5.2；磁性粒子(南京共达纳米应用研究所)，Fe3O4质量百分比含量大于95%，平均粒径20 nm左右，最大磁饱和强度为3千高斯；戊二醛(分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)，浓度为25%和50%；亲和层析多克隆兔抗鸡IgG(实验室制备).

仪器：752型紫外-可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司)；机械搅拌机(IKA)；扫描电镜(S-2700，日本日立集团).

1.2 实验过程

1.2.1 磁性微球的制备

(1)制备水相.称取0.2 g明胶、0.3 g壳聚糖和0.1 g磁性粒子，加入10 mL蒸馏水，70 ℃水浴边搅拌边加入100μL冰醋酸，待壳聚糖和明胶完全溶解并与磁性粒子混合均匀后，用0.1 mol/L NaOH调节pH到4.5～7.0[6]，得到2%明胶-3%壳聚糖-1%磁性粒子的复合溶液，室温备用.

(2)油水乳化.向三口烧瓶中加入20 mL液体石蜡和0.6mL span-80,60 ℃恒温水浴625 r/min搅拌混合30 min后,向其中逐滴加入5 mL水相样品，进行乳化.

(3)固化微球.乳化10 min后，同转速下改换4 ℃冰浴，使乳液迅速降温，使水相凝固初步定形成球.降温2 min后逐滴一次加入0.5 mL戊二醛交联30 min.逐渐升高水浴温度到30 ℃，继续固化反应90 min[7-9].反应结束后，乳液分别用石油醚、丙酮、异丙醇2 000 r/min反复洗涤后，避光自然晾干，得到褐色粉末.

1.2.2 磁性微球表征

(1)形貌表征.对磁性粒子进行扫描电子显微镜(SEM)的拍摄，观察壳聚糖/明胶磁性微球的大小、分散性和表面形貌.

(2)磁响应测定.每0.02 g磁性微球溶于pH 7.0的蒸馏水中，低温超声振荡混匀2 h，在磁力架上静置30 min，清液在420 nm处测吸光度A.A<0.05为磁响应良好[10].

1.2.3 磁性微球吸附BSA

按照表1，分别加入0.02 g/mL混匀的磁性微球溶液(pH7.0)、100μg/mL BSA和蒸馏水在1～6号离心管中， 37 ℃振荡2 h使BSA充分吸附在磁性微球表面，用磁力架分离磁性微球30 min，取清液用考马斯G250法测定595 nm处吸光度，计算蛋白质含量，确定BSA最佳加入量和吸附率[11].

表1 磁性微球对BSA的吸附

1.2.4 磁性微球吸附亲和层析兔抗β-CNIgG

同样地按照表1，仅将100μg/mL BSA换成层析纯化多克隆兔抗β-CNIgG,其它操作同前，计算亲和层析兔抗β-CNIgG最佳加入量和吸附率.

最佳亲和层析兔抗β-CNIgG加入量和磁性微球进行混合37 ℃振荡反应2 h，4 ℃放置6 h、12 h、24 h、48 h、72 h后分别取清液，用考马斯G250法在595 nm处测定吸光度，确定磁性微球对抗体的吸附稳定性.

2 结果与讨论

2.1 SEM电镜

2.1.1 制备得到的壳聚糖/明胶磁性微球的SEM照.

如图1(a)可以看到微球成球效果较好，表面光滑无凹陷，分散性好，球与球间粘连少.但也可以看到微球大小不够均匀，制备方法还有待于改善；图1(b)中微球表面光滑无凹陷，与标尺比对得到制备的磁性微球粒径在3～8μm之间.微球上出现了一些白色亮点，这是由于微球内部磁性Fe3O4粒子与喷金表面有不同的电荷密度，电镜对两者感光度不同，使照片中微球上出现白色亮点，证实了磁性粒子被包裹在微球内部.结果表明反相悬浮乳液包埋法可以制备形貌较好的磁性微球.

2.1.2 戊二醛浓度对壳聚糖/明胶磁性微球制备的影响

25%和50%的两种不同浓度的戊二醛对比制备的磁性微球的SEM照片如图2所示.

(a)600倍 (b)1000倍图1 壳聚糖/明胶磁性微球的SEM形貌

(a)25%的戊二醛100倍 (b)50%的戊二醛100倍 (c)25%的戊二醛450倍 (d)50%的戊二醛450倍图2 不同浓度戊二醛制备的壳聚糖/明胶磁性微球的SEM形貌

图2(a)可以明显看到25%戊二醛制备得到的磁性微球分散性较好，大小较为均匀，相比之下图2(b)50%戊二醛制备的产物异形团聚物较多，分散性不好；图2(c)中25%戊二醛制备的微球成球性好、表面光滑粘连少；图2(d)的产物成球性不好，非球形个体较多，箭头所指处表面凹陷粘连严重.

结果表明，25%戊二醛制备得到的磁性微球形貌更好.

2.2 磁响应效果

制备的磁性微球的磁响应性是对其表征的重要指标之一.选取了最优制备条件下的3个样品和3个温度进行磁响应性的测定，结果如表2所示.

表2 壳聚糖/明胶磁性微球磁响应性结果

从表2中可以看出,3个样品在3个温度的下吸光度A<0.05.其中，在4 ℃和20 ℃时，吸光度较低，表明磁性微球在低温时磁响应较稳定；40 ℃时，吸光度略有升高，是因为部分微球中未交联的明胶在升温后溶解，破坏了微球结构，使其失去磁性粒子后漂浮于溶液中，溶液吸光度略有上升，但均未超过0.05，表明40 ℃时磁性微球稳定性较好.

磁响应性实验结果表明，制备得到的磁性微球磁响应效果好.

2.3 磁性微球吸附蛋白质效果

2.3.1 吸附BSA

对3个磁性微球样品进行了BSA吸附效果的实验，结果如图3所示.

图3显示BSA加入量在0～40μg/mL范围内时，吸附于磁性微球表面的BSA量，随着BSA加入量增加而增加.当BSA加入量为40μg/mL时出现了拐点，继续增加加入量，吸附量趋于稳定不再出现明显增加.故40μg/mL为0.02 g/mL的磁性微球的最佳BSA加入量.通过公式：吸附率 =[(总加入量-上清液含量)/总加入量]×100%，可计算出BSA的吸附率为86.25%，吸附量为34.5±0.6μg/mL.

结果表明，制备得到的磁性微球对BSA有较好的吸附效果.

图3 磁性微球对BSA的吸附情况

2.3.2 吸附层析兔抗β-CNIgG

对3个磁性微球样品进行了IgG吸附效果的实验，结果如图4所示.

图4 磁性微球对IgG的吸附情况

图4显示IgG加入量在0～40μg/mL范围内时，磁性微球对IgG的吸附量，随着IgG加入量增加而增加.当加入量在40～60μg/mL范围内时，吸附量的增加不明显，40μg/mL为曲线拐点，故40μg/mL为0.02 g/mL的磁性微球的最佳IgG加入量.同样用吸附率公式可以计算出IgG的吸附量为19.6±1.0μg/mL吸附率为49.31%.

结果表明，制备得到的磁性微球对IgG有较好的吸附效果.

2.3.3 免疫壳聚糖/明胶磁性微球的时间稳定性

免疫磁性微球的时间稳定性结果如图5所示.

图5 时间变化对免疫磁性微球的稳定性的影响

图5显示，静置时间在0～24 h范围内，未吸附牢固的抗体进入清液，清液中的IgG量随时间延长明显增加.在24～72 h范围内，清液中的IgG量随着时间的延长增加不明显，48 h时清液中IgG的增加量第一次低于总加入量的1%，可以认为此时IgG与微球的吸附已经趋于稳定，48 h时IgG的吸附率为42.75%.

3 结论

本实验成功制备得到了粒径在3～8μm的表面光滑、分散性好的壳聚糖/明胶磁性微球.磁性微球稳定性较好，在高速离心和静置多日的情况下均未发生聚沉；25%戊二醛制备的磁性微球形貌较好；制备的磁性微球磁响应在4 ℃和20 ℃下均良好；磁性微球对BSA有较好的吸附效果，0.02 g/mL的磁性微球最佳的BSA加入量为40μg/mL，吸附率可以达到86.25%；磁性微球对层析兔抗β-CNIgG有较好的吸附效果，最佳加入量为40μg/mL，吸附率可以达到49.31%；制备的免疫磁性微球在48 h后趋于稳定，最终IgG吸附率为42.75%.

本试验制备磁性微球时，向油相中加入水相(磁粒子分散于壳聚糖/明胶溶液中)，通过调整两相组分的比例，控制合适的搅拌速度是水相充分乳化稳定的关键，其次是在固化交联前对乳液快速降温(4～7 ℃)使明胶凝固，使球体形状初步固化成形，可以减少微球粘连和异形球体的出现；另一关键点是，戊二醛使壳聚糖分子间交联，合适浓度的戊二醛理想情况是使球体表面交联成壳，形成表面光滑、分散性较好的微球，浓度过大会使交联过快出现球体表面凹陷、球体异形及球体间粘连等现象.

本实验仅对交联剂进行了研究，取得了阶段性结论，其他影响乳化体系的复杂因素还值得进一步探讨.

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