应用现代生物技术和设备测定和评估肝脏的心肌保护作用

刘树谦

美国西北大学 生物医学工程系，美国伊利诺斯州 埃文斯顿

0 前言

冠状动脉病变引起的心肌缺血可导致心肌细胞损伤和心功能衰退，但另一方面可激活心肌保护机制，抑制心肌死亡,改进心肌功能。哺乳动物包括人类有两种心肌保护机制：心源性的和非心源性的。心源性机制包括保护分子释放及心肌干细胞激活。在分子水平, adenosine , bradykinin, and opioids等小分子可以快速地(在几小时内)从损伤的心脏细胞释放到细胞外间隙, 作用于缺血心肌，激活G-蛋白耦合受体信息通道，进而激活细胞活性刺激分子PI3K和Akt1，引起细胞死亡分子BAD磷酸化，以此抑制心肌细胞死亡[1-6]。随着小分子的释放, 损伤心脏细胞及激活的白细胞也可在几天之内表达多种生长因子，包括成纤维细胞增长因子1和2，血管内皮生长因子，和胰岛素样生长因子。这些因子可激活酪氨酸激酶耦合受体及PI3K-Akt1和MEK-ERK1/2信息通道，进而刺激心肌细胞修复[7-20]。在细胞水平，心肌损伤可激活心源性干细胞。这些细胞可分化成心肌细胞, 进而促进心肌修复，改进心肌功能[21-23]。

非心源性心肌保护机制主要涉及系统器官和组织。骨髓和肝脏是目前发现的主要心肌保护器官。随着心肌缺血,骨髓可释放造血干细胞和血管内皮前体细胞于血液循环系统, 部分游离骨髓细胞可以进入缺血性心肌，促进心肌修复[24-27]。与此同时，心肌缺血引起心肌与血液促炎因子如interlekin-6的水平增加。这些因子可作用于肝脏，引发肝细胞表达心肌保护因子，包括-1-acid glycoprotein 2 (AGP2),bone morphogenetic protein binding endothelial regulator (BMPER),fibroblast growth factor 21 (FGF21), neuregulin 4 (NRG4), 和 trefoil factor 3 (TFF3)[53]。这些保护因子可释放于血液内，作用于缺血心肌，进而减少心肌损伤[28]。肝脏的另一个心肌保护机制是将肝细胞游离和释放于循环系统[29]。部分游离肝细胞可随血流进入缺血心肌[30]。这些细胞可能释放心肌保护因子，提升心肌保护因子的局部水平，因而到达迅速保护心肌的目的[28,30]。这里，作者将主要讨论应用现代生物技术和设备对肝脏的心肌保护作用的测定和评估。

1 肝源性心肌保护因子

心肌缺血可导致肝细胞表达心肌保护分泌蛋白因子。这些蛋白因子可以被释放入血液循环系统，随血流进入缺血心肌，因而保护心肌，减少心肌损伤[28-29]。这里我们将讨论三个问题: 这些蛋白因子是怎么发现的, 蛋白因子的长期心肌保护功能以及作用机制。

1.1 肝源性心肌保护因子的筛选

在小鼠冠状动脉结扎诱发的心肌局部缺血模型，肝细胞可在一到三天内增进九个分泌蛋白基因的表达，包括AGP2, BMPER, chemokine (C-X-C motif)ligand 13 (CXCL13),FGF21, NRG4, PRG4, serum amyloid A1 (SAA1)和 A2 (SAA2)，及TFF3[5,28]。鉴于这些蛋白在心肌缺血时表达，它们可能包括心肌保护因子。为识别其中的心肌防护因子，我们进行了功能筛选试验。在冠状动脉结扎之后，我们对心肌缺血小鼠立即进行肝分泌蛋白静脉注射(每组小鼠仅注射一种蛋白，50 ng/gm 体重, PBS为对照剂)。SAA1 和SAA2没有进行筛选试验, 因为这两种蛋白经常引起组织淀粉样病变和组织功能损伤[5,28]。在肝分泌蛋白注射后24 h，小鼠左心室被用于心肌梗塞测试。与PBS比较，注射AGP2,BMPER, FGF21, NRG4, 或TFF3导致显著心肌梗塞减少。相比而言，注射CXCL13或PRG4没有引起显著心肌梗塞改变。这些观察显示，AGP2, BMPER, FGF21, NRG4和TFF3有心肌保护的作用。在心肌缺血后一到三天,这些蛋白在肝细胞和血液都显著增加[28]。而心肌细胞死亡正好发生在这一时期[28]。可见这些蛋白是为心肌保护而生。

在以前的研究中，上述五个分子是从不同的细胞类种被发现的，并有着不同的功用[31]。AGP2，也称为 orosomucoid 2 (ORM2)，是肝细胞合成的急性炎症反应血液蛋白。其由201 氨基酸组成，分子量为23.6 kDa。AGP2的表达受多个促炎因子的调控，包括糖皮质激素，IL1，IL6和TNF。AGP2的以知功能包括调控炎症和免疫反应[32]。比如，AGP2可以抑制T淋巴细胞发育和增长[32]；抑制嗜中性粒细胞活性和增长[33]；抑制血小板聚合[34]；刺激单核细胞和巨噬细胞表达和分泌细胞因子，包括IL1，IL6，IL12 和肿瘤坏死因子[35]；以及刺激成纤维细胞增殖和促进伤口愈合[36]。

BMPER, 也称为 crossveinless 2, 是由 685 氨基酸组成 , 其分子量为76 kDa。BMPER 最处发现于Flk-1阳性血管内皮细胞。该分子可释放于细胞外空间,通过与BMP4相互作用来影响细胞的活性[32,57]。 BMP4的作用主要是参与调控Smad信号传导，控制中胚层发育,促进血管内皮细胞分化和血管形成,以及刺激成骨细胞和软骨细胞增长。但是,BMP4对BMPER的影响是有争议的。许多调查表明BMPER抑制BMP4的活性[38-40]，但也有人表明BMPER刺激BMP4的活性[41-43]。最近研究提供了解决这个争议的证据。BMPER可刺激或抑制BMP4的活性，其影响依赖于BMPER的相对水平。当BMPER的水平超过BMP4，BMPER可掩盖BMP4受体，从而抑制BMP4的活性。反之,BMPER刺激BMP4的活性[44]。

FGF21是由209氨基酸组成,其分子量为22.3kDa,属于成纤维细胞生长因子家族[45]。FGF21主要在肝脏表达。胸腺和脂肪组织也有表达,但表达程度较低[6,46]。大多数成纤维细胞生长因子有调节细胞增殖和分化的作用，而FGF21已知参与调节血糖和血脂代谢[47-48]。据报，FGF21有以下具体的代谢功能：[1]刺激细胞的葡萄糖摄取和代谢从而减少血糖水平; [2]诱导胰岛素表达和分泌；[3]调节脂肪细胞内脂肪酸代谢；[4]减少血浆低密度脂蛋白和增加高密度脂蛋白水平[47,49-53]。FGF21现已用于治疗糖尿病, 血脂紊乱和肥胖的研究。

NRG4, 也称为 heregulin 4 (HRG4)，由115氨基酸组成,分子量为12.7kDa,主要在胰腺和骨骼肌表达[54]。NRG4是一个细胞膜蛋白，其细胞外领域含有一表皮增长因子的部分。当合成后，NRG4既分布于细胞膜。其细胞膜外部分可由蛋白酶切割游离。游离NRG4可作用于酪氨酸激酶耦合受体HER4,进而调控细胞活性。NRG4的主要功用是刺激ErbB4阳性细胞生长,促进神经元轴突或枝状突起延伸,调控胰腺岛细胞发育[54-55]。

TFF3由80氨基酸组成,分子量为8.6 kDa,主要在胃肠道的杯状细胞表达。三环状氨基酸排列为该分子的结构特征。TFF3的主要功用是在生理条件下维持胃肠道黏膜完整性;促进损伤黏膜愈合和修复[56-57]。体外测试证明，TFF3可增强肠道内的黏蛋白聚合，以致形成稳定的胃肠道黏膜层。该黏膜层对胃肠系统有保护作用。

1.2 肝源性心肌保护因子的长期功能

肝源性心肌保护因子的主功能是增加心肌对缺氧的耐受性，减少心肌死亡和改进心肌收缩功能。我们使用组织化学和血液动力学方法评估肝因子对心肌的长期保护作用。当五个肝因子，包括AGP2，BMPER，FGF21，NRG4，和TFF3，按心肌缺血时血液肝因子浓度比注入心肌缺血的老鼠(静脉注射，每12小时一次，连续注射三天)，心肌梗塞范围在五，十，和三十天有很大程度减少[28]。连续注射三天的原因是这一期间正是心肌细胞死亡的时间。三天以后开始注射没有显著疗效。进而，五肝因子注射显著改进了左心室dp/dt和收缩指数。这些结果支持肝因子的心肌保护作用[28]。有一点应该强调，既然肝脏可产生心肌保护因子，为什么仍然需要注射这些因子来保护心肌。这是因为在心肌缺血以后这些蛋白因子的表达大约需要一天的时间。在这段时间，心肌在肝源性保护因子达到有效水平前已开始死亡。因此，注射心肌防护因子是必要的，而且是越快越好[28]。

1.3 肝源性心肌保护因子作用机制

一个重要的议题是肝蛋白因子如何保护缺血心肌。每一个蛋白因子都有一不同的作用机制。目前，我们已经研究了其中有两个因子：FGF21和TFF3[58-59]。FGF21可作用于心肌细胞酪氨酸激酶耦合FGF受体 1 (FGFR1)， 进而激活细胞活性刺激分子PI3K和Akt1，引起细胞死亡分子BAD磷酸化[58]。当BAD处于脱磷酸状态，可与抗细胞凋亡分子Bcl-2和Bcl-XL结合，从而抑制Bcl-2和Bcl-XL的抗细胞凋亡作用，导致细胞死亡增加。相反，当BAD处于磷酸化状态，Bcl-2和Bcl-XL由BAD释放出来，不再受BAD的抑制，导致细胞死亡减少，缺血心肌得以保护[30]。TFF3也可激活PI3K和Akt1，但其心肌细胞受体有待研究[59]。 可见，FGF21和TFF3激活细胞内的共同信号传导途径。

2 游离肝细胞对缺血心肌的保护作用

心肌缺血可导致肝脏细胞游离并释放于血液循环系统。部分游离肝细胞可随血流进入缺血心肌，进而保护心肌[28,30]。这里我们将讨论两个问题：肝细胞是如何释放的以及肝脏细胞如何保护缺血心肌。

2.1 肝细胞的释放和调控

随着心肌缺血的诱发，肝细胞可在三到天五内出现于血液循环系统。一个基本问题是如何确认循环肝细胞。我们建立了一个肝脏细胞特异黄荧光蛋白表达的小鼠模型[29]。循环肝细胞可根据黄色荧光蛋白来辨认。循环肝细胞的数量在心肌缺血后5天内可达到约白血球的1%，之后逐渐减少。部分游离肝细胞可随血流进入缺血心肌[30]。这些细胞在心肌缺血30天后基本消失。下面， 笔者将主要讨论肝细胞是如何游离和释放的。

缺血心肌以及在心肌病灶内激活的白血球可释放促炎因子interleukin 6 (IL6)。 该因子可进一步激活循环白血球。这些白血球可粘附于肝脏血管内皮细胞，迁移到肝组织， 表达并释放基质蛋白酶 2 (MMP2)。MMP2进而分解肝细胞外基质，导致肝细胞游离。游离肝细胞随血流进入肝中央静脉及腔静脉[29]。这些细胞可在静脉， 肺循环， 左心房， 和左心室系统生存。但是，一但游离肝细胞进入体动脉，这些细胞在动脉血流剪应力的作用下分解。所以， 在周边动脉和静脉是很难发现游离肝细胞的[5]。由于冠状动脉相对较短，进入冠状动脉的游离肝细胞不会全部被分解，部分细胞滞留于心肌。在心肌缺血诱发五至十天后，IL6和MMP2的表达和释放减少，肝细胞游离程度下降。

2.2 游离肝细胞对缺血心肌的保护

进入缺血心肌的肝细胞对心肌细胞有保护作用。虽然这些肝细胞如何保护心肌的机制仍未完全了解，但有一点比较明确，既进入心肌的肝细胞可释放心肌保护因子[28,30]。与释放于血液比较，直接释放于局部缺血心肌将迅速提升保护因子的浓度，有利于迅速有效地保护心肌。有一点应该说明，游离肝细胞仅出现于心肌缺血部位，但不出现在正常心肌。对这一现象的机制仍待研究。

3 生物技术和设备的应用

在该项研究中，我们采用了两种主要生物技术和设备：cDNA microarray analysis 和 flow cytometry。cDNA microarray analysis可用于系统性监测基因在某一细胞种类的表达。通过测定小鼠心肌缺血诱发的肝脏细胞全基因表达， 我们发现了如上所述的九个表达增强的蛋白， 其中包括五个心肌防护蛋白。Flow cytometry 可用于测定细胞种类和蛋白表达.我们就是使用了这个方法发现了心肌缺血时循环的肝细胞。cDNA microarray analysis[60-61]和 flow cytometry[62-64]的技术，设备以及作用原理已在文献中详细讨论，这里不再重复。可见，这些生物技术和设备在发现肝脏对局部缺血心肌的保护上起了至关重要的作用。

4 结束语

以上研究表明，心肌损伤可诱发系统性自体保护措施。肝脏活化是其中措施之一。肝脏已知有多种功能，如调控新陈代谢、产生胆汁、解毒、和产生血浆蛋白等。除这些功能之外， 肝脏也起心肌保护的作用。这一发现对理解心肌保护机制以及开发心肌保护措施有重要的意义。

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