桢楠种子萌发过程中丙二醛和氧自由基的变化

孙雁霞，罗建勋，龙汉利，辜云杰，邬晓勇*

（1. 成都大学生物产业学院，四川 成都 610106；2. 四川省林业科学研究院林业研究所，四川 成都 610081）

桢楠种子萌发过程中丙二醛和氧自由基的变化

孙雁霞1，罗建勋2，龙汉利2，辜云杰2，邬晓勇1*

（1. 成都大学生物产业学院，四川 成都 610106；2. 四川省林业科学研究院林业研究所，四川 成都 610081）

对桢楠（Phoebe zhennan）种子在萌发过程中丙二醛（MDA）和氧自由基（ROS）含量以及超氧化物歧化酶（SOD）活性进行了测定，以了解这些生理指标在种子萌发过程中的变化趋势。结果表明：SOD活性在种子发芽过程中呈上升趋势，当发芽完全后出现下降，之后趋于平缓；MDA和ROS的含量变化则相反，从种子吸胀开始到开始发芽，一直处于下降趋势，而在后期有上升趋势，并趋于平缓，这说明在桢楠种子萌发过程中SOD发挥了重要的作用，降低膜脂氧化程度，促进种子发芽。

桢楠；种子萌发；丙二醛；氧自由基；超氧化物歧化酶

桢楠（Phoebe zhennan）为樟科常绿大乔木，我国三级保护渐危种，目前主要分布于四川、贵州、湖北、湖南及浙江等省。四川有天然的桢楠分布，是组成常绿阔叶林的主要树种[1]。桢楠为中性偏阴的深根性树种，生长速度中等，木材材质优良，坚硬耐腐，木材用途广泛，是一种经济价值极高的名贵优良用材树种。同时因其树形挺拔、枝叶繁茂、四季常青，也是很好的庭园观赏和城市绿化树种。

一般认为种子在成熟和劣变过程中脂质过氧化是其重要原因之一，体内一些有害物质的积累如氧自由基等对细胞质膜有极大的破坏作用[2]。丙二醛（MDA）是膜质过氧化的最终分解产物，它的积累可能对膜和细胞造成一定的伤害。MDA的存在会毒害细胞膜系统、蛋白质和DNA，最终导致细胞膜的降解和细胞功能的丧失[3]。MDA的含量低，膜受损程度越小，相反，则膜受损程度越大[4]。目前，对桢楠的研究主要集中在种子表型多样性等方面的研究[1,5]，而对于其种子萌发过程中丙二醛和氧自由基的变化则未见报道，因此本试验以桢楠种子为材料，研究了在其萌发过程中丙二醛和氧自由基的含量变化，为桢楠种子的育种和林业栽培提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

研究对象为桢楠种子，于2011年秋冬季种子成熟后地面拾集自然脱落的种子，根据采收地点不同，分别将种子编号为：桢楠76、桢楠36、桢楠81、桢楠34。种子经沙藏层积处理后，于冰箱内（4±1）℃贮藏后进行发芽试验。

1.2 方法

1.2.1 发芽试验 4种桢楠种子每种分3组，每组50粒，经蒸馏水浸泡24 h后，置于双层滤纸的培养皿内，保持饱和含水量，在（25±1）℃的温箱内进行发芽试验，光照条件为12 h光暗交替。发芽过程中如遇种子感染发霉，可用流水轻轻冲洗种子后放回发芽，直到实验结束[6]。指标测定隔日进行，三次重复（下同）。

1.2.2 实验试剂和实验器材 三氯乙酸、硫代巴比脱酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、石英砂、亚硝酸钠，对氨基苯磺酸，a-萘胺，盐酸羟胺等（各种药品均为分析纯）。

CT15RT型高速冷冻离心机、7 200型可见光分光光度仪、HH-4数显恒温水浴锅、FA2004B型电子天平、DB-210SCB型电热鼓风干燥箱、冰箱、研钵、5 mL刻度离心管；刻度试管（10 mL）；镊子；移液管（5、2、1 mL）等。

1.2.3 丙二醛的含量测定[7]随机取培养皿中的种子，剥皮，洗净擦干，放入到预冷的研钵中，加入一定体积预冷的0.05 mol/L、pH7.8的磷酸缓冲液，在冰浴下研磨成匀浆，然后转移到刻度离心试管中，将研钵用缓冲液分3次洗净，将清洗液合并入离心管中，于8 000 r/min、4℃下离心15 min，上清液即为丙二醛提取液。

将上述离心后所得的上清液用磷酸缓冲液定容到刻度试管，吸取一定提取液，加入0.5%硫代巴比妥酸溶液，摇匀。将试管放入沸水浴中煮沸10 min后，立即放入冷水浴中冷却后，在8 000 r/min、4℃下离心15 min。离心后，以0.5%硫代巴比妥酸溶液为空白测532 nm、600 nm和450 nm处的消光值。

1.2.4 氧自由基的含量测定[7]制定亚硝酸根标准曲线：配置系列浓度的NaNO2，然后取1 mL NaNO2，分别加入H2O 1 mL、17 mmol/L的对氨基苯磺酸1 mL和7 mmol/L的a-萘胺1 mL，于25℃中保温20 min，然后测定OD530，以[NO2-]和测得的OD530值互为函数作图，制得亚硝酸根回归方程和相关系数。

氧自由基提取液的制备：取种子，剥皮，洗净擦干，然后放入研钵中，加入50 mmol/L pH7.8磷酸缓冲液进行研磨，之后冲液洗研钵2次，最后以10 500 r/min离心20 min，得上清液并用缓冲液定容，此溶液为氧自由基提取液。

取样品0.5 mL，加入50 mmol/L的磷酸缓冲液（pH7.8）0.5 mL、1 mmol/L的盐酸羟胺1 mL摇匀，于25℃中保温1 h，然后再加入17 mmol/L的对氨基苯磺酸1 mL和7 mmol/L的a-萘胺1 mL，混合，于25℃中保存20 min，取出以分光光度计测定波长在530 nm处的OD值。根据测得的OD530值，查亚硝酸根标准曲线图，将OD530换成亚硝酸根，然后依照羟胺与O－.（超氧自由基）的反应式：NHOH＋2O-.＋H＋→NO-＋HO＋HO从 [NO－

22222222] 对 [O－2.] 进行化学计量，即将 [NO2－] 乘以2，得到 [O－2.] 含量。

1.2.5 超氧化物歧化酶活性测定 SOD酶的提取方法参照参考文献[8]。活性测定采用邻本三酚自氧化法。

2 结果与分析

2.1 种子萌发过程中MDA含量的变化

MDA的含量是反应质膜稳定性的主要指标[4]。细胞膜的破坏是由细胞中产生的超氧物自由基（ROS）诱导膜质中的不饱和脂肪酸发生脂质过氧化作用造成的。脂质过氧化作用会产生MDA，MDA的含量可代表膜损伤程度的大小。MDA的含量越高，植物细胞膜遭受的透性伤害越大。由图 1可知，随着种子遇水吸胀，代谢产物MDA的含量在萌发初期较高，但随着时间的推移，可溶性蛋白增加，保护酶系统防御系统启动，MDA的含量随之减少。从种子吸胀开始到开始发芽，MDA一直处于下降趋势，说明种子吸胀初期细胞膜有一个修复的过程，而在后期有上升趋势，这可能与可溶性蛋白的大量消耗有关[9]。由图可知，桢楠76的丙二醛含量在整个发芽过程中均比其余3种种子的含量低，丙二醛含量大小顺序为：桢楠34 ＞ 桢楠81 ＞ 桢楠36 ＞ 桢楠76。这也与4种种子的发芽率和发芽势的规律一致。

2.2 种子萌发过程中ROS含量的变化

按照1.2.4的方法制定亚硝酸根标准曲线，如图2，相关系数R2= 0.999 6，线性关系良好。

在种子萌发过程中，氧自由基的含量随着种子吸水到种子开始发芽，均表现为降低的趋势，如图3。

植物细胞代谢过程中会产生活性氧（ROS），在正常生长和代谢情况下，细胞内ROS的产生和清除处于一种动态平衡。细胞内有清除ROS的非酶系统和酶系统，其中超氧化物歧化酶（SOD）第一个参与ROS的清除反应，在抗氧化酶类中处于重要地位[10]。ROS含量的大小与丙二醛的含量变化一致。

2.3 种子萌发过程中SOD活性的变化

从图4看出，桢楠种子在萌发过程中，SOD活性在种子发芽过程中呈上升趋势，当发芽完全后出现下降，之后趋于平缓。种子在萌发过程中会产生一系列活性氧簇，而SOD不断增加的活性可以把细胞中活性氧簇清除[11]，维持细胞正常的代谢活动，而在后期活性的降低则可能是活性氧的含量有大幅度的下降。从图中可以看出，SOD的活力表现为桢楠81最大，而桢楠34最小。

从以上3个指标可以看出，桢楠种子在萌发过程中，确实有抗氧化酶活性的升高以及一些活性氧和脂质过氧化产物含量的降低。

种子发芽过程是一个系统工程，离不开蛋白质和各种酶的参与。桢楠种子萌发过程中抗氧化保护酶、MDA以及ROS含量的变化，进一步证明了种子萌发的系统性，种子萌发过程中，保护酶之间相互协同，使氧自由基的产生和清除达到平衡，同时降低了MDA含量，使植物细胞免受氧自由基的伤害，保证了种子的正常萌发。

3 讨论与结论

种子在萌发期，种子中除成熟后积累的有害物质代谢会产生活性氧外，呼吸等正常代谢、种子吸胀过快、环境胁迫等都会导致大量的活性氧产生，生成更多的自由基等有害物质。在桢楠种子萌发过程中，SOD表现出逐渐升高的趋势，说明在种子发芽过程中SOD有清除活性氧和阻止活性氧形成，保证种子的正常萌发的作用。

实验表明，种子在萌发过程中，ROS含量随着种子吸水膨胀到发芽开始，呈现下降的趋势；SOD的活性也是随着种子开始发芽呈现上升趋势。

植物器官衰老时，往往发生膜脂过氧化作用，MDA是其产物之一，它的存在会毒害细胞膜系统、蛋白质和DNA，最终导致细胞膜的降解和细胞功能的丧失。MDA含量的高低在一定程度上可指示种子脂质过氧化程度的高低[12～13]。由以上结果可知，在桢楠种子萌发过程中，由于抗氧化酶系统的活化，SOD清除ROS的能力增强，因此ROS作用于细胞质膜的能力也减弱，故而其产物MDA的含量也降低。种子在未遇水吸胀萌发之前，处于自然老化过程，所以代谢产物MDA的含量在萌发初期较高，但随着吸胀开始，可溶性蛋白增加，保护酶系统防御系统启动，ROS产生速度变慢，MDA的含量随之减少。

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Changes of Contents of MDA, ROS and SOD during Seed Germination of Phoebe zhennan

SUN Yan-xia1，LUO Jian-xun2，LONG Han-li2，GU Yun-jie2，WU Xiao-yong2
（1. Faculty of Biotechnology Industry, Chengdu University, Chengdu 610106, China; 2. Research Institute of Forestry, Sichuan Academy of Forestry, Chengdu 610081, China）

Determinations were conducted on content of malonicaldehyde(MDA), oxygen free radicals(ROS) and superoxide dismutase(SOD) activity during the process of germination of Phoebe zhennan seeds. Results showed that the activity of SOD increased with germination, and stabled after germination, while the content of MDA and ROS decreased first and increased later. The determinations concluded that SOD played an important role in reducing the degree of membrane lipid oxidation and promoted seed germination.

Phoebe zhennan; seed germination; MDA; ROS; SOD

S722.1

A

1001-3776（2013）03-0001-04

2012-11-20；

2013-01-11

林业公益性行业科研专项“四川地震灾区灾后植被恢复及可持续发展关键技术研究与示范”（201104109）

孙雁霞（1976－），女，山西大同人，博士，副教授，从事植物生理与生物技术研究；*通讯作者。