骨髓间充质干细胞动员治疗缺血性脑损伤的实验研究进展

2013-01-26冯静静刘敬霞李建生河南中医学院第一附属医院河南郑州450000

中国老年学杂志 2013年14期

刘轲冯静静刘敬霞李建生 (河南中医学院第一附属医院，河南郑州 450000)

缺血性脑血管病是病理过程涉及复杂的时间和空间级联反应，致残率和致死率均较高。目前，临床治疗主要是通过超早期溶栓和脑神经保护等措施来挽救缺血半暗带的神经元和促进损伤后神经功能的恢复，虽然部分患者神经功能恢复较好，但仍有50% ～70%的存活者遗留瘫痪、失语等严重残疾〔1，2〕。目前研究最多的是骨髓间充质干细胞(BMSCs)为缺血性脑病的治疗提供了新途径，现就BMSCs动员治疗缺血性脑病的实验研究进展进行综述。

1 BMSCs的生物学特点

1.1 定义 Minguell等〔3〕将BMSCs概括为:存在于骨髓基质内的非造血细胞来源的细胞亚群，它们可以在体外扩增，在体外经诱导后最终分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌腱细胞、肌管、神经细胞与支持造血干细胞的基质。同所有的干细胞一样，骨髓也具有自我更新能力和多向分化潜能。它虽然仅占骨髓单核细胞的0.001% ～0.01%，且随着年龄的增加而减少，但是却具有惊人的增值能力。

1.2 BMSCs的体外分离、培养及分化 BMSCs是存在于骨髓中的一种非造血干细胞，可通过不同方法进行体外分离及培养，具有高度的增殖能力，易纯化，均一性好;体外培养时呈成纤维样集落形成单位，并贴壁生长。闫西刚等〔4〕发现BMSCs在体外分离、培养的条件下生长良好，经诱导后可大量分化为神经元样细胞和神经胶质细胞。杜振宗等〔5〕收集成人骨髓血，利用建立体外分离培养、纯化BMSCs的方法，观察BMSCs的增殖及生长特性。发现利用贴壁方法获取的BMSCs具有较强的增殖的能力，纯度高，可以作为组织工程的种子细胞，为组织工程血管的构建提供依据。徐龙强等〔6〕实验研究也发现在体外特定环境下诱导原代BMSCs向神经干细胞转化，并向神经元和神经胶质细胞分化。可见BMSCs作为一种较为理想的种子细胞，为治疗神经元性疾病提供了一个极为丰富的供体细胞资源平台。

2 BMSCs的可塑性研究

BMSCs具有的跨系谱、跨胚层分化的潜能称为BMSCs的可塑性。也称之为转分化或横向分化。过去认为哺乳动物中枢神经系统属不可再生组织，但近年来研究表明成体哺乳动物齿状回、嗅球和脊髓都存在神经发生，在体内外能化为包括神经细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞在内的神经细胞〔7〕。姚晓黎等〔8〕报道了多项实验研究认为BMSCs在一定的诱导条件下，可在体外体内分化成为神经干细胞、神经元小胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞等。而BMSCs的可塑性研究不仅是BMSCs能跨胚层分化为外胚层的神经组织细胞，同时也有研究表明BMSCs移植后对脑缺血后梗死灶周围神经细胞可塑性及突触在生的影响。为BMSCs动员疗法治疗缺血性脑病提供了理论依据。张小乔等〔9〕利用 SD大鼠制作脑缺血模型，并将实验大鼠随机分为假手术组、模型组、磷酸盐缓冲液(PBS)组和BMSCs组，分别通过测定梗死灶周围脑组织突触素(SYN，是突触重建和突触可塑性的重要标志)和脑源性神经营养因子(BDNF，一种重要的调节修饰已有的突触结构和诱导新的突触联系形成的神经营养因子)mRNA的表达来研究脑缺血24 h后移植BMSCs的大鼠神经缺损评分(NSS)，发现与模型组及PBS组大鼠相比，BMSCs组的NSS评分较低，但SYN和BDNF mRNA的表达则明显较高，结果证实经静脉移植BMSCs能促进脑缺血大鼠神经功能恢复，并在突触可塑性及突触再生中发挥作用，而突触的再生及神经的可塑性是脑缺血后神经功能长期修复的重要组成部分。

3 BMSCs动员和归巢

3.1 动员骨髓释放其干细胞到外周血的现象称为BMSCs动员。其动员的途径主要包括动员剂的应用、原位增殖及动员后移植。广义上讲，BMSCs动员指通过机体本身的代偿机制以及外界人为因素干预，促使BMSCs迁移到骨髓外，以增加循环血液中干细胞数量。狭义上，则主要指通过使用动员剂等药物进行干预促使BMSCs释放到外周血。目前所使用的动员剂主要有粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、基质细胞衍生因子(SDF-1)、血管内皮生长因子(VEGF)、干细胞因子(SCF)、白细胞介素(IL)-3、IL-12、IL-27和化疗药物，如环磷酰胺(Cy)等，以G-CSF、GM-CSF的应用最为广泛，G-CSF、GM-CSF在动员造血干细胞的同时，对EPC和骨髓基质细胞也有动员作用。G-CSF还可引起外周血中黏附分子升高，以影响干细胞对骨髓基质和EPC的黏附作用〔10〕。这一过程同时涉及一系列细胞黏附分子和趋化因子、生长因子等的相互调节反应，影响干细胞的黏附、迁移和定居特性，使干细胞穿过基质膜和血管内皮层进入循环血流中，致外周血中的干细胞数增加。

3.2 归巢 BMSCs的归巢特性是指它们能自动向损伤及炎症区域的定向迁移。进而动员的BMSCs才可能完成对缺血损伤部位的修复。BMSCs能够表达多种细胞因子及趋化因子，而许多研究表明，缺血性脑病患者存在局部和全身的炎症反应，在患者的血液中炎症分子包括细胞因子(TNF-α、IL-1B、IL-8、IL-18)和可溶性黏附因子〔L-selectin、E-selectin、P-selectin、可溶性黏附因子(ICAM)、血管细胞间黏附因子(VCAM)〕升高〔11〕。这意味着BMSCs有向缺血损伤区组织局部趋化的能力。有研究认为，移植含有血管内皮细胞(EPC)的混合细胞成分(这些细胞多可以合成释放多种促进BMSCs迁移、分化和血管新生的因子，如 VEGF、SCF、G-CSF、SDF-1等)，更有利于促使中风后缺血边界区的血管生成，改善缺血组织的血液循环，缓解缺血状态〔12〕。

4 BMSCs动员治疗缺血性脑损伤的可能机制

4.1 BMSCs自身分化为神经元样细胞和神经胶质样细胞BMSCs具有多潜能干细胞的特性，在特定条件下可以打破胚层起源的限制向外胚层神经元细胞和内胚层肝卵圆细胞分化，发展为成熟神经细胞，替代损伤细胞，重建神经环路，从而达到恢复神经功能的目的〔13〕。郭闻师等〔14〕实验研究证实大鼠的BMSCs体外多次传代后，经全反式维甲酸(ATRA)和神经生长因子(NGF)诱导后可分化为神经细胞元样细胞和神经胶质细胞。同时实验研究结果显示单味中药如仙茅水提物诱导后的BMSCs有神经元特异性烯醇化酶(NSE)和肢质纤维酸性蛋白(GFAP)表达，促进BMSCs向神经元细胞和神经胶质细胞的分化和转化化。作用机制可能为:①增强细胞Na-K-ATP酶的活性，直接增加细胞代谢，促进细胞分裂，②增加某些细胞受体开关的启动，而这些受体的启动促使其向神经元细胞分化〔15〕。

4.2 刺激内源性神经干细胞和神经祖细胞的增殖分化在正常情况下，中枢神经系统内存在尚未激活的神经元。脑缺血后，BMSCs进入体内后，可能通过某种机制激活了这些神经干细胞，从而再生为神经细胞和神经胶质细胞，促进了神经功能的恢复;郭亮等〔16〕将BMSCs注入大脑中动脉栓塞后的大鼠体内并在移植前的48 h在细胞培养液中加入10 μmol/L BrdU进行标记，28 d后在荧光显微镜下可见脑梗死灶(海马)边缘聚集大量BrdU阳性细胞，而健侧脑组织中BrdU阳性细胞数量相对较少。脑梗死灶边缘可见少量BrdU阳性细胞表达神经元特异性烯醇化酶。说明BMSCs可促进局灶性脑缺血大鼠内源性神经前体细胞的增殖、迁移，从而对脑缺血再灌注损伤起保护作用。

4.3 应用G-CSF动员促进神经功能的恢复目前已经证实G-CSF是BMSCs强有力的动员剂，当脑缺血损伤时，G-CSF可动员大量BMSCs向损伤部位迁移，在特定的病理环境下分化为神经细胞，以修复损伤的神经组织〔17〕。其作用机制研究进展可能为以下几个方面。

4.3.1 抑制脑缺血损伤神经细胞凋亡研究证明，大鼠大脑中动脉闭塞后再灌注的神经细胞凋亡是伴随着坏死发生的，而BMSCs能够刺激内源性神经细胞再生，抑制细胞凋亡，从而减少缺血再灌注损伤细胞凋亡的发生，明显改善脑缺血大鼠的神经功能〔18〕。黄月等〔19〕研究证明，向脑缺血再灌注后大鼠注入BMSCs能上调Bcl-2蛋白表达，下调Bax蛋白表达，减少神经细胞凋亡，改善脑损伤大鼠的神经功能。刘雪平等〔20〕观察应用G-GSF动员自体BMSCs对大鼠脑缺血后神经凋亡的影响。他们将SD大鼠随机入选的72只分为模型动员组、模型非动员组和假手术组;用线栓法制备大鼠局灶性大脑中动脉栓塞/再灌注模型，并以CD34和Brdu免疫组化染色观察比较大鼠脑缺血/再灌注后的新生血管生成情况，模型动员组大鼠脑组织缺血再灌注后48，72 h缺血区边缘可见新生毛细血管生成且逐渐增多，72 h至1 w后可见大量新的毛细血管，与模型非动员组比较，48 h后细胞凋亡改善明显;而模型未动员组仅有少量新生毛细血管;48 h后缺血区新生毛细血管密度也较低。结果表明，BMSCs经G-CSF动员后可向大鼠脑缺血区趋化并可分化为神经元前体细胞，显著促进脑缺血区血管再生，降低脑神经功能评分，降低细胞凋亡率。李建生等〔21，22〕实验研究结果也显示，应用G-GSF动员BMSCs并联合中药脑脉通(由大黄、人参、川芎、葛根组成)可以抑制脑缺血损伤引起的神经细胞凋亡，影响相关凋亡蛋白 Fas、Fasl、caspase-3及 Bax、Bal-2的表达，其作用机制可能为在脑缺血早期下调了的促凋亡基因Fas、Fasl及Bax的表达，后期上调了抑凋亡基因Bal-2的表达，进而阻抑caspase-3引起的凋亡瀑布反应，从而发挥对脑缺血神经细胞凋亡的阻抑作用。

4.3.2 促进脑缺血损伤后血管新生张子强等〔23〕研究表明应用G-CSF动员自体骨髓干细胞，能够促进大鼠脑组织缺血区的血管新生，改善缺血局部血流灌注并促进其脑功能的恢复，其机制应该是部分动员的EPC“归巢”到脑缺血区并分化形成新生血管。

4.3.3 促进缺血性损伤后神经功能的恢复脑缺血后造成大量神经元细胞缺失导致中枢神经系统损伤后的功能难以恢复。目前的药物治疗作用有限。近年来随着干细胞研究的深入，发现BMSCs是一组具有多向分化潜能和自我更新能力的细胞群，在生长和修复过程中起重要作用。葛朝莉等〔24〕实验研究发现G-CSF作为BMSCs强有力的动员剂，可以大大提高外周血的干细胞数量。说明G/CSF能够改善脑缺血大鼠的神经功能。而多项实验研究结果也证实在缺血性脑梗死的急性期给予实验大鼠腹腔内注射G-CSF，循环中被动员的干细胞数量会明显增加，因而在缺血脑组织局部炎症反应的“呼唤作用”下，归巢的干细胞数量增多，而归巢干细胞的绝对数量决定了大鼠梗死脑容积减小、缺血区新生血管再生，进而改善脑缺血大鼠的神经功能〔25，26〕。

5 问题与展望

尽管近年来有关人BMSCs的分离、培养和神经分化潜能及脑缺血性疾病应用方面的研究很多，并取得了较大的进展，但仍存在一些问题有待解决。如BMSCs培养的标准化及干细胞身份的确定是相关研究的前提，并且现在仍有尚未被证实的骨髓干细胞表面标志，因此在BMSCs的鉴定上存在困难。而关于BMSCs的具体治疗机制仍未明了，BMSCs能否分化为具有完全功能的宿主神经细胞并与宿主细胞建立正常联系，重建缺血损伤的神经功能;在促进内源性干细胞增殖等方面是否具有更为积极的修复作用尚不得而知;与BMSC s研究的整体水平相比，中医药对BMSCs作用的研究尚处于探索阶段，相关的文献报道较少。总之，BMSCs动员在治疗缺血性脑损伤方面具有广阔的发展前景。BMSCs向神经细胞方向分化的潜力及移植后对实验动物缺血性脑损伤的功能改善作用为人类的神经系统疾病尤其是脑缺血性疾病的治疗提供了一条新的途径。

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