自噬对衰老的调节及其分子机制的研究进展
2013-01-25郭亚男吉林大学白求恩第一医院内分泌科吉林长春3002
郭亚男 刘 青 (吉林大学白求恩第一医院内分泌科,吉林 长春 3002)
人口的老龄化将成为21世纪人类社会面临的重要问题之一,一些发达国家的人均年龄有望超过80岁且有继续增长的趋势〔1〕。随着人口的逐渐老龄化,探索衰老的生物学基础及其相关的分子学机制成为现在科学研究的一个重要课题。最新的研究发现细胞内不断积累的受损的大分子物质及细胞器是引起多种真核生物衰老的“激动剂”,并导致它们的生存能力下降〔2〕。而自噬是真核细胞中一种重要的分解代谢过程,可以降解细胞中受损的大分子物质及细胞器,并可使之再循环成为细胞所需的能量及基本物质〔3〕。研究发现几乎在所有细胞及组织中,自噬水平的减低与生物体的衰老表型有着密切的联系,并会引起衰老相关疾病的进一步加重〔4〕。这些研究都证明自噬对衰老的生理及病理过程有着重要的调节作用。
1 自噬与AMPK/mTOR/ULK1信号通路
自噬(autophagy),即自我吞噬作用(autophagoeytosis),是存在于真核生物细胞中的一种高度保守的、维持细胞内环境自身稳定的重要保护性机制。在生理情况下,细胞的自噬功能保持在一个较低的基础水平,可通过清除细胞内少量受损的细胞器(如线粒体等)和生物大分子(如蛋白质),维持细胞正常的生理功能。但是,在某些应激情况下(例如,营养缺乏、缺血等),细胞的自噬活性可明显上调,细胞可降解自身成分,释放出游离氨基酸和脂肪酸等降解成分,用于补充能量缺乏和生物大分子的合成以便维持细胞的生存〔5〕。
在营养缺乏的条件下,自噬作用可以使胞质中的物质循环利用,用来生物合成或产生能量,以维持内环境的稳态。越来越多的研究发现自噬在生物的生命活动中起着复杂的作用,除了能量限制外还有很多种干预手段可以启动自噬,另外自噬过程中自噬体所吞噬的物质是有选择性的。第一个被确认的是自噬相关基因(autophagy associated gene,ATG1),这个基因可以编码蛋白激酶复合物中的催化亚基从而激活自噬〔6〕。在酵母菌自噬特异性蛋白ATG1与ATG13以复合物的形式对自噬起着重要的作用,在哺乳动物中,自噬特异性蛋白ATG1的同源体分别为(uncoordinated 51-like kinase 1,ULK1)和 ULK2,其中ULK1通过与ATG13及FIP200的复合物发挥作用,同时受到哺乳动物雷帕霉素靶点复合物1(mammalian target of rapamycin complex 1,mTORC1)的负性调控〔7〕。近期研究表明在哺乳动物中能量缺乏可以通过激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-actived protein kinase,AMPK)而直接使 ULK1磷酸化,从而激活自噬〔8,9〕。
AMPK被普遍认为是细胞能量状态的感受器,受ATP/ADP的调控〔10〕。研究过程中发现在营养缺乏时,自噬和AMPK同时被激活,于是很多实验开始研究这两者之间的关系。然而最初对肝脏的研究中得到的结果与人们预期的相反,AMPK的特异性激活剂5-氨基-4-氨甲咪唑核苷(AICAR)抑制了自噬〔11〕。接着在后来一系列关于酵母菌的研究中进一步证明了AMPK与自噬的关系〔12〕。酵母菌通过空泡(即哺乳动物的溶酶体)储藏糖原,只有在十分饥饿时为酵母菌提供能量,也为酵母菌苞芽的形成提供能量基础,当自噬功能减弱时会引起酵母菌长期的糖原积累障碍。蔗糖非酵解相关激因(SNF1)基因(编码酵母菌中AMPK同源体的基因)的突变,在引起酵母菌一系列缺陷的同时,主要减少了糖原的积累,在此条件下提高ATG1与ATG13这两种基因的表达增强了糖原的积累,这证明了SNF1/AMPK对自噬起到正向调控的作用。Wang等〔12〕证明了在酵母菌中SNF1/AMPK在调节自噬功能和糖原积累中是ATG1/ATG13的上游。
最早发现AMPK是通过对雷帕霉素靶蛋白复合体(mTORC1)的调节来实现对自噬的调控的。mTOR通路普遍存在于酵母菌和哺乳动物中,被公认为对自噬起负向调节作用,用TORC1阻断剂雷帕霉素阻断该通路可以增强自噬作用〔13〕。AMPK通过两条独立的通路对TORC1进行调节,一是AMPK可以激活 TORC1上游的(the tuberous sclerosis complex 2,TSC2)的磷酸化,从而使(Ras homolog enriched in brain,Rheb)的GTP磷酸水解酶灭活,达到抑制 TORC1的作用〔14〕。而在TSC2敲除的酵母菌中,AMPK通过磷酸化TORC1复合物中的Raptor亚基从而使14-3-3蛋白积累,抑制了mTOR的活性〔15〕。由此发现AMPK通过mTOR通路对自噬的调控在哺乳动物和酵母菌中是不同的。
最近研究〔9,16,17〕发现了新的 AMPK 调控哺乳动物自噬功能的分子机制,把AMPK与ULK1联系起来,Egan等通过生物学信息方法在AMPK原有序列标记位点中找出潜在的AMPK作用底物〔15〕,ULK1作为候选的底物之一,它存在4个与AMPK反应的位点。苯乙双胍(AMPK激活剂)刺激的细胞通过质谱分析,鉴定出三个磷酸化位点:S555、T574和S637,通过磷酸化抗体鉴定出S467这个位点。Kim等〔17〕发现哺乳动物细胞可以通过无糖培养(饥饿状态)可以激活并磷酸化ULK1,AMPK阻断剂(Compound C)可以阻断这一过程。这些科学家通过系统突变和体外磷酸化反应鉴定ULK1的磷酸化位点,最终发现两个AMPK磷酸化的重要位点:S317和S777。同时有研究〔16〕证明AMPK是通过它的γ亚基与ULK1发生相互作用的,同时验证了AMPK可以在体外磷酸化ULK1。由上述研究可以得出通过建立营养物质缺乏(低糖环境)模型,可以激活哺乳动物的AMPK,从而使自噬中重要的始动因子ULK1发生磷酸化。
尽管现在以得出饥饿和AMPK可以激活ULK1的结论,但具体机制仍有争议。其中AMPK对ULK1的磷酸化位点是一个争议的焦点。Kim等〔17〕认为Shaw所证明的S555及T574不是AMPK的作用位点。而Shang等〔18〕用稳定同位素标记的氨基酸培养细胞及质谱分析,报道了人类细胞的ULK1有13个磷酸化位点,而这13个位点中不包括Kim等〔17〕发现的S555和S637(人类细胞中的位点是S556和S638),但是该研究认为营养缺乏引起了大量ULK1的去磷酸化,其中S638与S758是两个重要的去磷酸化位点,而Kim等〔17〕人认为这两个位点是mTOR的磷酸化位点,在营养缺乏的条件下TORC1的活性被抑制,这两个磷酸化位点的磷酸水平降低。Kim等认为在营养缺乏的条件下磷酸化作用阻断了AMPK的结合,所以要恢复AMPK水平必须使mTOR的活性降低。而Shang等〔18〕认为在营养缺乏条件下ULK1的S758位点的去磷酸化作用使得AMPK与ULK1分离从而激活ULK1。
总的来说,通过AMPK、mTORC1、ULK1之间的相互作用调控哺乳动物的自噬功能是肯定的。但具体的作用机制有待进一步的研究,尤其是ULK1的磷酸化及它与AMPK之间的相互作用机制。通过以上的讨论可以发现在不同的细胞和实验条件下存在多种自噬调控途径。ULK1是一种大分子蛋白质,有着丰富的丝/苏氨酸磷酸化位点,尽管现在有一些先进的分子生物学技术,但弄清这些位点的作用仍是一件巨大的工程。但值得肯定的是在高等真核生物中会有越来越多关于AMPK/mTOR/ULK1信号通路与自噬的研究。
2 抑制自噬功能引起衰老的过早出现
很多研究报道ATG蛋白质类或其他自噬相关蛋白例如Sirtuin1在衰老组织中的表达降低,并且随着衰老的进展自噬作用逐渐减退。在正常老年人的脑组织中ATG5、ATG7和Beclin1的表达减少〔19〕,而在有胰岛素抵抗和代谢综合征的老年人脑组织的Sirtuin1的表达减少〔20〕,在患有骨关节炎的老年人脑组织中 ULK1、Beclin、微管相关蛋白(LC3)的表达下调〔21〕。同样的肌醇三磷酸(IP3)受体信号通路在衰老相关疾病(神经性退化疾病、心脏肥大等)时被激活,再次说明了自噬作用的降低与衰老有着密切的关系〔22〕。虽然只有现象学的观察,但这些研究已经表明自噬的减弱可能造成衰老的过早出现。
不管在酵母菌还是在哺乳类动物中通过外在干预下调自噬都会引起衰老的过早出现及寿命的缩短。在有关线虫的研究中〔23〕,ATG1/ULK1、ATG7、ATG18 及 Beclin 等基因失去功能的突变,会引起线虫寿命的缩短。同样的ATG1、ATG8及Sestrin1的表达缺陷会缩短果蝇的寿命〔24〕。敲除关键的ATG蛋白质类对于刚出生的小鼠来说是致命,因为自噬对小鼠从孕育到断奶过程中细胞内能量的储备活动的作用是必不可少的〔25〕。组织特异性敲除ATG基因较少引起明显的表型改变,而是引起各种衰老相关的特异性沉淀物(脂褐素、受损的线粒体等)的明显增加。
一些研究〔26〕证明通过改善衰老相关的自噬缺陷可以影响衰老相关的表型,在衰老小鼠的肝脏亮氨酸酸性核蛋白2a(LAMP2a)表达水平降低,而通过建立LAMP2a转基因小鼠模型提高LAMP2a的表达水平,这些转基因小鼠较同龄野生型小鼠年轻,这一作用是通过恢复LAMP2a的正常水平的表达从而避免衰老相关的分子伴侣介导的自噬和大分子自噬作用衰减,同时还减弱了肝脏中氧化产物、泛素化蛋白聚集物、凋亡细胞的积累〔26〕。在肥胖、糖尿病、高脂饮食、先天性瘦素缺乏时肝脏的自噬功能也会减弱。在肝脏细胞中通过干预高表达ATG7,可以增强肝脏细胞的自噬作用,从而减轻内质网应激反应,中和胰岛素抵抗。这些研究都证明了衰老与自噬功能的不足有着密切的联系。
3 增强自噬延缓衰老、延长寿命
最早在对线虫的研究中证明通过抑制胰岛素样生长因子信号通路可以提高自噬作用,同时延长线虫的寿命,当诱导重要的自噬相关基因突变时,即使抑制了胰岛素样生长因子通路仍不能延长线虫的寿命〔27〕。热量限制(减少食物的摄入但不引起营养不良),在抗衰老及延长寿命中所起的重要作用已经在对各种动物的研究中得到肯定,包括在对恒河猴的研究〔28〕中发现热量限制可以减少糖尿病、心血管疾病、肿瘤、脑萎缩的发病率。流行病学调查研究〔25〕热量限制对人类的健康也是有益的,而且通过控制食物摄入干预自噬功能是一种非常符合生理的手段。热量限制对自噬的调控主要是通过AMPK、SIRT1这两个能量感受因子实现的。另外热量限制还可以通过对胰岛素类生长因子信号通路及mTOR同路的抑制从而增强自噬作用。
不管在对酵母菌还是果蝇的研究中发现,当mTOR通路已经被抑制时,热量限制将不再延长它们的寿命,这些研究进一步证明了热量限制是通过mTOR信号通路来调控自噬和衰老的。而mTOR对衰老的调控是通过对其下游的核糖体蛋白激酶(S6K)或起始因子4E结合蛋白(4EBP)的调控实现的。当过表达有活性的S6K时,即使用雷帕霉素抑制mTOR也不能起到延缓衰老的作用〔29〕。S6K表达的缺失会引起AMPK的激活从而增强自噬延缓衰老,在对AMPK缺失的线虫的研究中发现S6K的缺失并不能延长线虫的寿命〔30〕。
4 展望与小结
随着社会人口的老龄化,人们对衰老及衰老相关性疾病日益重视。对衰老的研究由生物水平延伸至分子水平,而自噬作为衰老过程中一种重要的调节机制也备受关注。由上面的各种研究我们得出AMPK、mTOR在自噬与衰老中都起着关键的作用,这两种分子物质使得自噬功能与衰老的调控发生了一系列密切的关系,而且在许多研究中已经证明了增强自噬可以延缓衰老及增长寿命,但其中的机制尚未完全清楚,尤其是对AMPK、mTOR作用底物的研究尚存在很多争议,进一步弄清这些机制对明确自噬与衰老的关系,寻找新的干预靶点,从而达到延缓衰老及预防衰老相关疾病的发生有着重要的意义。
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