病灶组织HPV、PCNA和nm23检测在宫颈癌分型中的价值

周 静 (新疆伊犁州妇幼保健院，新疆 伊犁 835000)

宫颈癌是比较常见的妇女恶性肿瘤之一，近年来该病在我国的发病率有增高趋势，发病年龄日趋年轻化。按照癌细胞病理特点的分类，宫颈癌分为鳞状细胞癌(80% ～90%)、腺癌(10%-15%)和其他腺鳞癌〔1〕。人乳头瘤病毒(HPV)是一种球形DNA病毒，属于乳多空病毒科的乳头瘤空泡病毒A属，能引起人体皮肤黏膜的鳞状上皮增殖。目前高危型(HR-HPV)持续感染被认为是宫颈癌的确切致病病毒〔2〕。增殖细胞核抗原(PCNA)大部分存在于增殖细胞的细胞核中，是细胞细胞合成期必不可少的因子，亦是增殖期特异性表达的核蛋白。nm23是第一个被发现的转移抑制基因，其异常表达与多种肿瘤的转移及预后相关〔3〕。本文将病灶组织HPV、PCNA和nm23检测应用于宫颈癌分型。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择我院2009年4月至2012年4月手术切除宫颈癌的患者共184例。年龄61～77〔平均(65.6 ±4.8)〕岁。其中鳞状细胞癌125例、腺癌43例和其他腺鳞癌16例。对照组30例为正常宫颈组织切片。所有病例手术切除前均未行放疗及化疗，样本检查前24 h内禁止性生活，3 d内无阴道内冲洗、上药，检查前不进行醋酸或碘液涂抹。

1.2 方法

1.2.1 HPV检测方法

1.2.1.1 检测材料 采用美国爱迪旺斯医疗科技有限责任公司生产的赛泰-细胞/组织HPV检测试剂盒;常规试剂磷酸盐缓冲液(PBS)、复染试剂等，来自本院病理研究室。

1.2.1.2 检测方法 (1)取样使用一次性宫颈脱落细胞采集器，将其放入宫颈口处，单方向旋转4～5周以获得足量的上皮细胞样本，取出后放入样本管中充分搅拌。(2)采用免疫组织化学检测样本管中子宫颈细胞核中浓度低于0.01 pg(10～12 g)的HPV壳蛋白的抗原，仅有一个被染色的细胞核呈红色即可做出阳性诊断，具体实验步骤按试剂盒说明书操作。

1.2.2 PCNA检测方法

1.2.2.1 检测材料 链霉亲合素-复合物(SABC)试剂盒、鼠抗增殖细胞核抗原(PCNA)单克隆抗体、二氨基联苯胺(DAB)显色剂等均购自北京中杉金桥生物技术有限公司;常规试剂(PBS、复染试剂等)，来自本院病理研究室。

1.2.2.2 检测方法 手术切除的病理组织样本以甲醛(10%中性)固定、常规石蜡包埋，连续切片厚度在4～5 μm，再用脱腊和水化。以已知阳性片作为阳性对照，PBS代替一抗作阴性对照，按试剂盒说明操作进行实验，显微镜下观察结果。PCNA以细胞核出现清晰的棕褐色为阳性表达。

1.2.3 nm23检测方法

1.2.3.1 检测材料 SABC试剂盒、nm23鼠抗单克隆抗体、DAB显色剂等均购自北京中杉金桥生物技术有限公司;常规试剂(PBS、复染试剂等)，来自本院病理研究室。

1.2.3.2 检测方法 手术切除的病理组织样本以甲醛(10%中性)固定、常规石蜡包埋，连续切片厚度在4～5 μm，再用脱腊和水化。以已知阳性片作为阳性对照，PBS代替一抗作阴性对照，按试剂盒说明操作进行实验，显微镜下观察结果。nm23蛋白以胞浆出现棕黄色为阳性表达。

1.3 评分方法 每张样本切片由2名医师双盲观测10个视野(×400)，阳性表达率用1 000个细胞中阳性细胞的百分数表示，采用双评分半定量法分别对染色强度和阳性细胞百分比进行统计评分。

1.4 统计学方法 采用SSPS12.0软件处理数据，计量资料用t检验。

2 结果

2.1 正常宫颈组织和宫颈癌鳞状细胞癌、腺癌和其他宫颈癌的HPV表达差异 HPV在宫颈鳞癌、宫颈腺癌、其他宫颈癌患者阳性表达率分别为91.2%、93.4%、93.7%，与正常宫颈组织(6.3%)比较存在明显差异(P＜0.05)。

2.2 正常宫颈组织和宫颈癌鳞状细胞癌、腺癌和其他宫颈癌的PCNA表达差异 PCNA在宫颈鳞癌患者阳性表达率达84.80%，在宫颈腺癌患者达25.00%，在其他宫颈癌患者达18.75%，均高于正常宫颈组织(6.6%)(P＜0.05);此外，PCNA在宫颈鳞状细胞癌中的阳性表达率与正常宫颈组织、腺癌和其他宫颈癌有明显差异 (P＜0.05)。

2.3 正常宫颈组织和宫颈癌鳞状细胞癌、腺癌和其他宫颈癌的nm23表达差 nm23在宫颈鳞癌、宫颈腺癌、其他宫颈癌患者阳性表达率分别为45.6%、41.8%、43.3%，与正常宫颈组织(76.7%)比较存在明显差异(P＜0.05)。

3 讨论

宫颈癌是妇科常见的恶性肿瘤，是鳞状上皮内瘤由低度向高度发展，最后恶化到浸润癌的复杂病理过程，癌基因的激活及抑癌基因的失活是细胞癌变的分子基础，其发生与转移与细胞增殖活性及某些基因突变有关〔4〕。宫颈癌多发生在25～40岁，每年新增病例50余万，近年来该病有年轻化的趋势〔5〕。按照癌细胞病理特点的分类，分为鳞状细胞癌(80% ～90%)、腺癌(10%～15%)和其他腺鳞癌。宫颈癌分型与癌病变的分子标志物有很大的联系，分析宫颈癌病理变化过程中分子标志物的临床实验参数将有助于更好地理解宫颈癌的病理变化过程，确诊宫颈癌的分型，根据不同的宫颈癌分型临床采取适合的治疗方案，提高疗效，降低死亡率。

HPV是一种双链闭环小DNA病毒，属于乳头瘤病毒科，具有种属特异性的嗜上皮生物特性。流行病学研究表明，HPV感染与宫颈癌的发生密切相关，现已知20余种与癌症相关的HPV型别，根据HPV与宫颈癌病理变化程度的关系，可将HPV分为低危型和高危型两种〔6〕。Feng等〔7〕认为HR-HPV持续感染是宫颈癌发生的必要条件和首要因素。本文研究显示90%以上宫颈癌患者受HPV感染，故HPV检测数据可用于确诊是否患有宫颈癌。

PCNA是一种酸性核蛋白，在DNA复制中作为DNA多聚酶δ的辅助蛋白起着重要作用，不仅可用于检测恶性肿瘤的增殖细胞有效标记物，还可用于评价肿瘤的增殖指数和生物学行为。其含量变化与细胞的增殖状态密切相关，静止期细胞含PCNA的量极少，G1后期细胞中的PCNA合成增加，S期达高峰，G2/M期明显下降。因此PCNA含量可作为反映肿瘤细胞预后和增殖程度判断性指标，检测恶性肿瘤的增殖细胞有效标记物，并用于评价肿瘤的增殖指数和生物学行为〔8〕。本研究发现宫颈癌患者PCNA在宫颈鳞状细胞癌中的阳性表达率达80%以上，与正常宫颈组织、腺癌和其他宫颈癌有明显差异。故PCNA检测数据可用于确诊是否患有鳞状细胞癌。

nm23基因可编码产生二磷酸核苷激酶(NDPK)，NDPK的主要作用是通过促进微管聚合而参与G蛋白介导的磷脂酰肌醇信号传递途径，参与细胞分裂纺锤体的形成，影响细胞的附着、粘连和活动，从而抑制癌变细胞的转移和浸润，故是一种与恶性肿瘤转移相关的基因〔9〕。Marone等〔10〕认为nm23基因的临床试验参数与癌变细胞浸润、转移和恶化程度呈负相关，即组织癌变程度越高，则nm23实验参数越低，利用这种关系可将nm23作为判断治疗和预后的临床指标。本文研究也显示nm23在宫颈癌组织中的阳性表达率明显比正常宫颈组织低，该差异具有统计学意义，与上面提及的研究相符。故nm23基因的检测数据可作为宫颈组织恶变的信号。

综上所述，虽然病灶组织HPV、PCNA和nm23检测用于宫颈癌分型的应用研究目前尚且还处于发展阶段，HPV检测数据可用于确诊患者是否患有宫颈癌，而PCNA检测数据可用于确诊是否患有宫颈癌常见的类型鳞状细胞癌，nm23检测数据则可作为宫颈组织恶变的信号。

1 郑巧荣，崔金全.宫颈上皮内瘤变及宫颈癌中 TS、PCNA的表达及其意义〔J〕.中国妇幼保健，2011;26(7):1083-5.

2 Pimple S，Muwonge R，Amin G，et al.Cytology versus HPV testing for the detection of high-grade cervical lesions in women found positive on visual inspection in Mumbai，India〔J〕.Int J Gynaecol Obstet，2010;108(3):236-9.

3 李荣丽，刘恩彤.nm23和p53在宫颈癌组织中的表达及意义〔J〕.中国医药导报，2009;6(18):7-8.

4 Mccarthy KS，Miller LS，Cox EB，et al.Correlation of biochemical and immuno-histochemical methods using monoclonal antireceptor antibodies〔J〕.Arch Lab Med，1985;109(6):716-21.

5 张露丹，刘玉玲.HPV L1壳蛋白联合HPV分型检测在宫颈癌筛查中的价值探讨〔J〕.中国妇幼保健，2012;27(3):340-2.

6 包 颖，刘 明，朱金福，等.液基细胞学和高危型 HPV DNA检测在宫颈癌筛查中的相关性〔J〕.中国实用医药，2012;7(18):60-1.

7 Feng J，Al-Abbadi MA，Bandyopadhyay S，et al.Significance of high-risk human papillomavirus DNA-positive atypical squamous cells of undetermined significance pap smears in perimenopausal and postmenopausal women〔J〕.Acta Cytol，2008;52(4):434-8.

8 Olivares D，Gisbert JP，Pajares JM，et al.Helicobacter pylori infection and gastric macosal epithelial cell apoptosis〔J〕.Rev Esp Enferm Dig，2005;97(7):505-20.

9 郭 晰.PCNA和nm23在宫颈癌中的表达及其临床意义〔J〕.临床医药实践，2008;6(1):373-5.

10 Marone M，Scambia G，Ferrandina G，et al.Nm23 expression in endometrical and cervical cancer:inverse correlation with lymph node involvement and myometrial invasion〔J〕.Br J Cancer，1996;74(6):1063-8.