指纹图谱技术在黄芩质量控制中的应用

2013-01-25赵金娟管仁伟戴雪梅林建强林慧彬

中国野生植物资源 2013年3期

赵金娟，管仁伟，戴雪梅，林建强，林慧彬

(1.山东中医药大学，山东济南250014;2.山东省中医药研究院，山东济南250014;3.山东大学微生物技术国家重点实验室，山东济南250100)

黄芩是我国的传统常用中药材，为唇形科多年生草本植物黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi.)的干燥根，具有清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎等功效。黄芩中含有黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素等黄酮化合物以及挥发油，苯乙醇糖苷类等成分。黄芩质量评价多以黄芩苷等成分含量的高低来判别。但是，由于黄芩成分的复杂性，单一成分很难确切的评价其质量。中药指纹图谱技术以其多成分、综合性的特点，成为评价中药质量较好的一种方法。它将中药的色谱图、光谱图、波谱图等转化为数字化的指纹谱，并由此衍生的一系列参数和特定的计算公式所得到的数据作为判断依据，用于中药质量的控制、中药材品种的鉴定等［1］。药用黄芩除黄芩外，部分地区还使用甘肃黄芩(S. rehderiana Diels)、粘毛黄芩(S. viscidula Bge.)等，此外，不同种质的黄芩药材性状与成分也有差别。指纹图谱技术为黄芩的质量控制提供一个较为有效的方法。

1 黄芩的高效液相指纹图谱

李化等运用了RP - HPLC 建立了黄芩不同生长期的指纹图谱，发现黄芩在生长发育过程中苷类成分含量经历了升高-降低-再升高-再降低，苷元类成分含量则发生了降低-升高-再降低-再升高的变化，虽然二者含量的变化趋势明显不同，但含量最终均在枯黄期恢复到接近休眠期时的含量水平［2］。在黄芩不同部位的研究中，运用高效液相色谱图得出，苦芩中黄芩苷的含量比条芩的高，苦芩的根部比苦芩的根茎部膨大部分含量要高;条芩中黄芩苷含量相对较低，其中主根中含量最多，其次是条芩侧根、条芩根茎连接处、条芩侧根、条芩茎［3］。对于黄芩的采收期，以黄芩苷为指标，建立的陕西省不同采收期黄芩的标准指纹图谱显示，秋季采收的黄芩样品相似度明显高于春季采收的样品［4］。在黄芩不同中医调剂品中，生品与酒制样品在不同的酒制过程中有近一半的成分发生明显变化，且主要是极性较小成分的变化;酒炒与酒炒炭样品无明显区别［5］。

2 黄芩的毛细管电泳指纹图谱

毛细管电泳是以毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力的新型分离分析技术。与传统的电泳相比，毛细管电泳以其分离效率高、快速、微量、自动化、易微型化、分离模式多样化等特点在中药鉴定研究、中药有效成分的测定、中成药研究、中药指纹图谱研究、中药药理及新药开发方面发挥了重要作用。与高效液相相比，毛细管电泳的毛细管柱具有不容易被污染且污染后容易清洗的特点使其适合分析成分复杂的中药材及其制剂样品，因其采用了柱上富集技术，从而具有了和HPLC 相当的灵敏度，另外毛细管电泳还可以与质谱联用，有效地将CE 高分离效率和MS 的定性优势相结合，可以同时进行中药材及其复方制剂的指纹图谱定性和多种成分的多指标定量［6］。

应用胶束电动毛细管电泳色谱法对组织培养诱导获得的12 个黄芩多倍体株系、黄芩不同部位和不同采收期进行的黄芩苷含量测定，发现绝大部分四倍体株系黄芩苷的含量高于二倍体，且明显高于商品药材;黄芩主根、须根中黄芩苷的含量最高，根皮次之，茎叶中含量最低;黄芩种子成熟后期和冬季黄芩苷含量较高，春季发芽前后黄芩苷的含量就开始下降［7］。以254 nm 作为检测波长，以50 mmol/L 硼砂(pH7.94)为运行缓冲液，分离电压20 kV，30 ×103Pa 下压力进样10 s 的电泳条件，建立的黄芩毛细管电泳指纹图谱，对5 个产地的黄芩药材的指纹图谱进行的比较，发现5 个产地黄芩药材的指纹图谱的图貌基本一致，但各共有峰的相对峰面积有所不同，表明黄芩中各成分含量的差异与其生长环境密切相关，不同产地，峰面积比值有较大差异［8］。

3 黄芩的红外光谱指纹图谱

红外光谱突出的特点是具有高度的特征性，除光学异构体外，每种化合物都有自己的红外吸收光谱，以其对气、固、液态样品均可进行分析，且分析速度快，样品用量少，操作简便的特点，在药物研究和质量控制等方面起到了重要作用。在红外光谱中1 250 cm-1～400 cm-1的低频区为指纹区，各个化合物在结构的微小差异在指纹区都会得到反映。目前红外光谱在定性分析、纯度检查、定量分析等方面得到了广泛的应用。

采用红外光谱、二阶导数红外光谱以及二维相关红外光谱，对黄芩生品及酒制品进行的三级鉴定分析表明，在红外光谱中，黄芩生品及酒制品的红外光谱十分相似，但通过导数光谱分析，发现在1 741 cm-1、1 411 cm-1处吸收峰在经过炮制之后向高波数位移，1 357 cm-1处吸收峰在经过炮制之后向低波数位移;二维红外谱图显示的药效组分特征差异明显，生黄芩在1 300 cm-1～800 cm-1波数范围内有4 个特征蜂，以1 575 cm-1最强;酒黄芩的自动峰有2 个区域，且各区域内自动峰均为正相关［9］。而在黄芩的近红外漫反射光谱研究中，通过与SIMCA聚类分析技术的联用可以识别不同产域的黄芩，基本达到了对不同产地的黄芩以及野生与栽培黄芩的快速无损鉴别［10］。

4 黄芩的DNA 指纹图谱

利用RAPD 和AP -PCR 从不同生物样品中人工合成DNA 片段，而这种DNA 片段的大小、数目因不同的生物而异，即为“DNA 指纹图谱技术”。DNA指纹图谱技术具有操作简便、灵敏度高的优点，鉴别结果不受环境因素、样品形态、和材料来源的影响，因此可为中药鉴定提供更加准确可靠的手段。目前，DNA 指纹图谱技术在易淆品种的鉴别、不同产地相同品种的鉴定、药材道地性鉴定等方面都有了广泛的应用［11］。

利用RAPD 技术对黄芩种内的种质资源进行的遗传多样性分析，发现不同种源黄芩样品的主谱带基本一致，但不同样品的次谱带之间存在着不同程度的差异，利用随机引物对不同物种基因组DNA 进行扩增，其多态性表现不同，实验中所选的黄芩材料间的多态性为80%，其遗传多样性较高，表明各种源黄芩间存在着较大的遗传差异［12］。

段莲华通过对黄芩的DNA 指纹分析发现，高、中、低纬度的黄芩内部用同一引物扩增出的条带基本相同;在高、中、低纬度的黄芩之间，仅有少数引物得到可以明确区分3 者的不同条带，即不同纬度黄芩间的遗传有一定的变异，而居群内部的变异很小;而DNA 指纹图谱与质量相关性研究结果表明，虽然不同品种的同一引物扩增出的条带基本相同，但有少数引物扩增出的条带在黄芩苷含量高低品种间有明显区别;质量好、含量高的DNA 指纹图谱具有一条特异带，而其他的黄芩无此带［13］。

在对黄芩种子的研究中，蛋白质电泳发现黄芩种子图谱中一级带6 条，二级带1 条，黄芩种子的RAPD 扩增，S4 为引物，黄芩种子有3 个条带，以S11 为引物，黄芩种子有3 个条带，2 个亮带［14］。

5 黄芩的X 射线衍射指纹图谱

粉末X 射线衍射Fourier 指纹图谱分析方法是利用中药材中的成分对X 射线的衍射效应而进行的鉴定分析。龚宁波等采用该方法对黄芩药材进行了鉴定分析并对黄芩苷成分进行了研究，获得其特征性衍射数据，利用粉末X 射线衍射Fourier 图谱分析方法实现了对黄芩药材中黄芩苷的定量分析［15］。

6 结语

6.1 中药指纹图谱的建立，是对中药质量控制的补充和提高。目前施行的质量标准在一定程度上反映了原药材、中间体及生成品的质量，但由于中药自身所含成分的复杂性，任何单一的活性成分或指标成分都难以准确、全面地评价中药质量，不仅不能进行真伪鉴别和优劣判别;有很多情况所检测的指标成分还不具有“唯一性”，如熊果酸、齐墩果酸等同属其他植物也均含有该成分。中药指纹图谱的建立可以全面反映中药所含内在化学成分的种类和数量，进而反映中药的质量，尤其是在现阶段中药的有效成分绝大多数没有明确，采用中药指纹图谱的方式，将有效地表征中药质量，同时指纹图谱也为国际社会所认可，有利于中药及其产品进入国际市场［16］。

6.2 植物药与动物药均属生物类物质，除有门、纲、目、科、属、种等系统分类的不同外，还受到诸多因素如光照、温度、湿度、地理条件、病虫害、人为因素等对其生长培育的影响，因此生物样品即使是同一品种也还存在个体差异和可变性，造成品质上的显著不同或较大的波动，不可能像化学合成药品那样具有一个特定不变的质量标准［1］。此外，中药混淆品种，伪劣药材以及人为掺杂时有出现，如何区分真伪优劣，保证药品质量已成为燃眉之急。鉴于此，进行中药材指纹图谱的深入研究对于建立更加完善有效的药材质量评价与鉴别方法十分必要。

6.3 在黄芩的生产、采收、产地加工、贮存、炮制、调剂、制剂等过程中，质量是一个动态变化的过程。用指纹图谱技术考查这个动态变化过程的研究还较少，部分研究多集中在HPLC 指纹图谱，而在光谱指纹图谱、DNA 指纹图谱的研究较少，开展这方面的研究对于全面提高黄芩的质量控制水平意义重大。

6.4 研究中药质量的影响因素，探讨中药质量的变化规律，进而对其质量进行全程动态监测与调控，是确保中药质量稳定、均一和可控的关键，中药指纹图谱技术是质量控制的可行手段。以系统的化学成分研究和药理学研究为依托，采用中药指纹图谱技术对黄芩质量进行控制，对建立全面的系统的黄芩质量控制体系有重要作用，有利于黄芩现代化研究，为黄芩走向国际化市场提供了有利条件。

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