中药多糖抗神经细胞缺血/缺氧性凋亡研究进展

2013-01-25胡国柱

中成药 2013年4期

关键词：缺氧性神经细胞线粒体

向勤，胡国柱

（1.南昌大学医学院，江西南昌330006；2.江西省人民医院临床医学研究所，江西南昌 330006）

中药多糖抗神经细胞缺血/缺氧性凋亡研究进展

向勤1，胡国柱2

（1.南昌大学医学院，江西南昌330006；2.江西省人民医院临床医学研究所，江西南昌 330006）

神经细胞缺血/缺氧性损伤是诱发多种神经系统性疾病发病的因素之一。多糖是中药有效成分之一，具有抗氧化和抗凋亡等生物活性。本文就缺血/缺氧与神经细胞凋亡的关系及中药多糖抗神经细胞缺血/缺氧性凋亡机制的研究现状做一综述。

中药多糖；缺血；缺氧；神经细胞；细胞凋亡

细胞凋亡（apoptosois）是细胞由基因控制的自主有序的细胞死亡，而脑组织缺血/缺氧易导致神经细胞凋亡［1］。中医理论认为细胞作为构成生命体结构和功能的基本单位包含两方面的属性，即细胞增殖属阳，细胞凋亡属阴，增殖与凋亡的平衡是阴阳在细胞水平反应。一旦增殖与凋亡平衡紊乱则出现阴阳的偏盛偏衰的病证。机体细胞异常增殖为阳盛，而凋亡减退为阴微；细胞增殖减退为阳微，而凋亡过盛为阴盛，这是中医对肿瘤形成及自身免疫性疾病发生的病理生理学认识，这些变化与多种免疫缺陷病和退行性病变有关。诱导细胞凋亡的中药现已发现绝大多数用于抗癌，如小柴胡汤其黄芩苷元可引起典型细胞凋亡。而许多补益类中药能抑制细胞凋亡，如枸杞多糖能抑制地塞米松诱导的小鼠胸腺细胞凋亡，六味地黄汤能抑制糖皮质激素诱导的胸腺淋巴细胞凋亡。成人继发T细胞免疫缺陷症用六味地黄汤（丸）进行滋阴补肾［2-3］。中医学认为肾藏精，生髓通脑，故脑发育由肾所主。肾虚可导致脑发育障碍，应用恐伤方法制作孕鼠肾精亏虚模型，经熟地黄、枸杞子、制首乌、淫羊藿等组成的中药补肾填精方煎剂灌胃治疗恐伤孕鼠，结果模型组仔鼠海马区脑组织Bcl-2阳性表达数下降、Bax阳性表达数升高，而补肾组则Bcl-2阳性表达数上升、Bax阳性表达数显著下降（P＜0.01）、仔鼠海马区脑组织细胞凋亡率也显著下降（P＜0.05）［4］。中药多糖作为中药药效成分之一，参与了机体的各种生命活动，其中包括抗氧化、抗细胞凋亡、抗衰老等，且毒副作用小，应用前景非常广阔。本文就中药多糖成分抗缺血/缺氧引起的神经细胞凋亡的作用及机制做一综述。

1 细胞凋亡的生物学特征

细胞凋亡时胞体缩小，胞膜有小泡状形成，膜内侧磷脂酰丝氨酸外翻到膜表面，细胞质密度增加，线粒体膜电位消失，通透性增大，细胞色素C释放到胞浆，核质浓缩，核膜核仁破碎，DNA降解成为约180～200 bp片段或其整数倍［5-6］。细胞在凋亡的整个过程中质膜完整，细胞内含物不外泄，不会发炎症反应。

2 脑缺血/缺氧与神经细胞凋亡及凋亡途径

脑血管痉挛、脑栓塞、甚至脑出血均能引起脑缺血/缺氧，导致神经细胞凋亡。目前缺血/缺氧或再灌注诱导神经细胞凋亡机制还不是很清楚，但兴奋性氨基酸释放增加，如谷氨酸、天门冬氨酸［7-8］；细胞内自由基大量产生，如羟自由基、超氧阴离子［9］；细胞内离子平衡被打破，如胞浆Ca2+增加［10］、Na+/K+-ATP酶活性下降所致的胞内外Na+/K+平衡紊乱［11］；线粒体损伤，如膜通透性的改变导致细胞色素C、凋亡诱导因子等多种活性物质泄入胞浆等［12］；凋亡相关基因表达失衡，如Bcl/Bax比值下降等均可能在凋亡过程中发生重要作用。并最终通过三条主要途径介导细胞凋亡：①外源性途径：死亡受体如Fas、TNFR等在配体FasL、TNF-α刺激下，通过接头蛋白 FADD将Caspase-8酶原招募到细胞质膜上，形成死亡诱导信号复合物DISC。Caspase-8酶原在这个复合物中被活化，进而激活下游的Caspase蛋白家族并引发级联反应，诱导细胞凋亡［13-14］。②内源性途径：生长因子、激素、细胞因子，以及自由基、缺氧、病毒感染等非受体介导的凋亡刺激，引起BH3-only蛋白家族（BAD、BIK、BID等）活化，导致线粒体外膜通透性转换孔开放、膜电位下降，促使线粒体向细胞质内释放细胞色素C、丝氨酸蛋白酶Omi以及其它凋亡诱导因子，释放的细胞色素C与Apaf-1和Caspase-9前体形成凋亡复合物，并活化Caspase-9。活化的Caspase-9激活下游的Caspase级联反应，或者线粒体释放的另外的凋亡因子EndoG，AIF［15-16］等，直接进入细胞核，引发DNA断裂，引发细胞凋亡。③穿孔素-颗粒酶B途径：颗粒酶B进入细胞后直接裂解天门冬氨酸残基活化Caspases蛋白［17］，促进Caspase级联反应，引发细胞凋亡。由此可见，细胞凋亡是多通路、多环节、多层次和高度复杂的可控过程，并且每一条途径并不是孤立存在，而是相互交错，联系在一起的。而中药多糖具有多靶点、多途径等中药作用的典型特点，可以同时活化几条抗凋亡通路，体现出抗凋亡作用的多样性。

3 中药多糖抗神经细胞缺血/缺氧性凋亡作用及机制

不同种类的中药多糖由于构成其多糖的单糖种类和比例的不同，其分子量、空间结构、溶解度，以及生物活性也不尽相同，并体现药理作用的多样性。中药多糖成分不仅有抗辐射、抗炎症、抗病毒［18］、抗凝血、抗肿瘤［19］、降血脂和血糖［20］，提高机体免疫还具有抗氧化和衰老，抗神经细胞缺血/缺氧性损伤作用。

3.1 抗自由基损伤自由基是细胞代谢过程中产生的具有氧化活性的物质，它能使细胞内的生物大分子和细胞膜中的脂质超氧化，引起细胞结构和功能的损坏。细胞内的自由基主要包括活性氧基团（ROS）和活性氮基团（RNS），如羟自由基与帕金森病（Parkinson's disease）密切相关［21］。中药多糖对自由基有很强地清除作用，刁波等［22］发现质量终质量浓度为2.5～10 mg/mL的刺五加多糖能够有效地降低H2O2刺激的海马神经元丙二醛（MDA）、ROS的水平并对海马神经元氧化损伤有保护作用。魏炳栋等［23］研究发现黄芪多糖、枸杞多糖和人参茎叶多糖均能有效地清除细胞内的羟自由基，并且复合多糖较单一多糖具有更强的清除力，从而保护了细胞生物膜系统的稳定性，抑制细胞凋亡。马庆华等［24］研究发现0.056 mg/mL白术多糖能够使衰老大鼠大脑皮质超氧化物歧化酶（SOD），谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活力增强，MDA水平降低，并有效地抑制DNA的损伤。由此可见，中药多糖可以通过提高细胞SOD，谷胱甘肽（GSH）的活性达到清除胞内氧化自由基的目的，抑制氧自由基对线粒体膜和mtDNA的损伤，提高细胞对mtDNA的修复能力，抑制细胞凋亡［25］。

3.2 作用于细胞内的信使神经细胞缺血/缺氧性损伤极易造成细胞外Ca2+的内流和线粒体内Ca2+的释放，而游离的Ca2+可调节蛋白激酶C（PKC）、酪氨酸蛋白激酶偶联的受体及cAMP或cGMP、核酸内切酶和磷酸水解酶的活性，引起细胞膜结构的破坏、兴奋性递质和氨基酸的增加、DNA的损伤等，中药多糖对由这种途径造成的细胞损伤有一定的抑制作用。汪茜等［26］参照改良的Longa线栓法建立大脑中动脉栓塞模型大鼠，在研究黄芪多糖对缺血缺氧脑损伤大鼠脑组织Ca2+和兴奋氨基酸的影响时发现，黄芪多糖能够明显降低缺血缺氧损伤大脑组织中总Ca2+水平，缓解缺血/缺氧对神经细胞造成的进一步损伤。体外培养的神经细胞研究表明［27］，当去除神经营养因子后提高胞内cAMP水平有明显抑制细胞凋亡的作用。但也有研究表明细胞内cAMP水平的增加也可以诱导细胞凋亡［28］。梁霜等［29］研究发现低剂量的玉郎伞多糖能够提高大鼠大脑中cAMP的水平，而高剂量的玉郎伞多糖可以抑制cAMP的活性。一氧化氮（NO）作为一种重要的气体信号分子主要由神经元和血管内皮细胞分泌，对维持海马细胞的认知能力具有重要的作用，而神经一氧化氮合成酶（nNOS）对大脑NO的合成起着决定性的作用，而NOS活性的增加引起线粒体能量障碍，线粒体中的细胞色素C水平增加并释放到胞浆中，引起细胞凋亡［30］。研究表明刺五加多糖能够明显减低氧化损伤的海马神经元中NO的水平，其可能的机制是抑制了神经元中诱导型一氧化氮合酶（iNOS）mRNA的表达［31］。

3.3 调节凋亡相关基因的表达在线粒体介导的细胞凋亡途径中Bcl-2蛋白家族起着重要的调控作用，而Bcl-2蛋白家族成员根据其功能分为Bcl-2，Bcl-x，Bcl-w等凋亡抑制分子和Bax，Bak，Bad，Bid等凋亡促进分子。当细胞受到内部的（如DNA损伤）或者外部的（如药物、自由基）刺激时，细胞将凋亡信号传递给线粒体后，引起线粒体膜通透性的改变，线粒体释放大量的凋亡诱导因子（如细胞色素C）到细胞质中，促进细胞发生凋亡。而在抗凋亡的信号通路中核转录因子-КB（NF-КB）处于中心位置，大脑内神经细胞因子通过丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶AKT活化NFКB，进而转录激活凋亡抑制因子，从而抑制细胞凋亡［32］。另一方面在促进细胞凋亡的信号中，转录因子p53可以通过上调Bax的表达水平，以及下调Bcl-2的表达或通过死亡信号受体蛋白途径诱导细胞凋亡的发生［33］。研究表明黄芪多糖经原位末端标记法（TUNEL）具有抗缺氧/缺血诱导的大脑海马区神经细胞凋亡的作用，免疫组化发现黄芪多糖可以抑制脑出血后核因子NF-КB的高表达，加速缺损的神经功能恢复［34-35］。应用免疫细胞化学，Hoechst33342荧光染色，DNA电泳以及AnnexinV/PI双染流式细胞仪测定等方法研究黄精多糖抗神经细胞缺血/缺氧性凋亡时发现，0.5～1.5 mg/mL的黄精多糖具有明显的抗神经细胞缺血/缺氧性凋亡作用，并随着质量浓度的增加抗凋亡作用增强。进一步研究发现缺氧前加入黄精多糖可以上调神经细胞内Bcl-2蛋白的表达，下调Bax蛋白的表达。由此可推测黄精多糖可能通过调节凋亡基因的表达，来调节Bcl-2/Bax比值来实现抗细胞凋亡作用的［36-37］。芦荟多糖抗脑缺血大鼠模型研究表明，芦荟多糖给药组与阳性组和模型组比较细胞凋亡蛋白caspase-3表达量显著下降（P＜0.01），p53蛋白的表达量较模型组也显著降低，说明芦荟多糖可以通过抑制caspase-3蛋白、p53蛋白的表达抑制细胞凋亡［38-39］。

3.4 对神经递质的影响脑内神经递质中的儿茶酚胺、乙酰胆碱（Ach）、γ-氨基丁酸（GABA）、谷氨酸、组胺和小肽类等均对脑功能具有维持作用［40］。脑缺血/缺氧容易导致γ-氨基丁酸释放减少谷氨酸释放增加，脑内神经递质代谢紊乱［41］，而释放的谷氨酸可以通过线粒体途径介导细胞凋亡［42］。杨娟等［43］运用神经干细胞谷氨酸损伤模型模拟脑梗死中神经元缺血缺氧性损伤时发现，高浓度的刺梨多糖对神经干细胞谷氨酸损伤具有保护作用，推测其可能是抑制谷氨酸钠所引起的Ca2+升高。张振东等［44］采用反复缺血/再灌注法造模，研究土党参多糖对小鼠脑缺血/再灌注损伤的保护作用时发现，土党参多糖能够明显降低小鼠海马区神经元损伤，并且中剂量的土党参多糖能够明显抑制Ach水平的下降，高剂量的土党参多糖能够明显降低乙酰胆碱酯酶（AchE）的活性。由此可见，中药多糖可以通过调节脑内神经递质代谢平衡而达到保护脑损伤的目的。

3.5 作用于热休克蛋白脑缺血/缺氧或再灌注神经细胞损伤后引起细胞的应激反应，产生热休克蛋白抑制应激诱导的c-Jun N-terminal激酶（JNKs）的激活，从而减少细胞凋亡［45］。有研究表明，缺血/缺氧再灌注1 h后热休克蛋白70有高表达，而热休克蛋白70合成的增加能减轻细胞的凋亡，并阻止细胞启动自杀途径［46-47］。王志鹏等［48］运用免疫组化和western-blot方法研究大黄多糖对脑损伤后大鼠脑皮层热休克蛋白70表达，结果发现大黄多糖可以促进热休克蛋白70的表达，启动内源性的保护机制保护受损的脑组织，加快脑损伤的康复。可见中药多糖可以促进热休克蛋白70的表达，抑制细胞发生凋亡。

4 展望

虽然已经发现部分中药多糖成分有一定的抗缺血/缺氧或再灌注诱导的神经细胞凋亡的作用，但仍缺乏不同药性的中药其多糖抗缺血/缺氧或再灌注诱导的神经细胞凋亡作用系统性研究，以及抑制细胞凋亡的机制系统研究。因此，进一步深入对不同药性的中药其多糖进行抗缺血/缺氧性神经细胞凋亡的系统性研究十分必要，其将有助于中药的开发应用，以及疾病治疗的新组方的创立和应用，为中医药的现代化提供基础。

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R285.5

1001-1528（2013）04-0815-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2013.04.043