卵黄抗体制备影响因素及其在动物生产中的应用

湖南农业大学动物科学技术学院 李玉莲 曹满湖 肖 勇夏 敏 龙次民 范志勇

卵黄抗体（IgY）又称卵黄免疫球蛋白，是禽类经特异性抗原刺激由B淋巴细胞产生并移行至卵黄中的特异性抗体。由于IgY具有性质稳定、特异性强、制备成本低、制备方法简单、可规模化生产等众多优点已被开发为一种高效的生物制剂，甚至被制成含特定抗体的饲料添加剂饲喂动物。本文就IgY制备的影响因素及其在动物生产中的应用作一综述。

1 卵黄抗体的特性

IgY是母鸡经特异性抗原刺激在孵育过程中由血清中的免疫球蛋白G（IgG）转移到卵黄中形成的。IgY的结构呈Y字形，分子质量约为180 kD，沉降系数为7 S，由两条重链和两条轻链构成，含有4个功能区，无铰链区。与IgG相比，IgY摆动性和柔韧性较低，结构更稳定，这可能与IgY分子重链和轻链之间有一个富含脯氨酸残基和甘氨酸残基的转换区相关。IgY性能稳定，具有良好的热稳定性，对酸碱有一定的耐受力，抗特定酶解尤其可抵抗幼年动物的胃酸屏障。Larsson等（1991）研究指出，IgY在65℃中活性可保持1 d以上，在4℃下贮存5年或室温下贮存6个月抗体活性基本不下降；IgY在pH为4.0～11.0时最稳定，当pH高于11.0或低于4.0时活性才会降低。Yokoyama等（1993）研究发现，IgY能够抵抗幼年动物胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的消化。由于种属差异性，禽类IgY与哺乳动物IgG之间不发生交叉血清学反应；IgY不与类风湿因子、葡萄球菌A蛋白、链球菌G蛋白和哺乳动物的Fc受体相结合，不激活哺乳动物的补体系统。

2 卵黄抗体制备影响因素

IgY制备效果受诸多变量共同影响，很难对单一因素的重要性做评估。禽的饲养情况、种属、日龄、抗原剂量、佐剂、抗原的施用途径和IgY的分离纯化等均对卵黄抗体的效价有影响。

2.1 禽自身因素对卵黄抗体制备的影响 禽本身情况对IgY制备的影响主要表现在种属、日龄等方面。Erhard等（2000）比较笼养和地面饲养的免疫鸡特异性IgY浓度和平均IgY总浓度，结果发现，笼养鸡的两项指标均明显高于地面饲养。制备IgY一般可使用商品蛋鸡，也可用SPF鸡。商品蛋鸡与SPF鸡相比，价格低且可在蛋鸡开产前就进行免疫制备抗体，但应注意商品蛋鸡的饲养环境，在健康良好的环境中饲养，才可减少因环境应激对IgY制备效果的影响。大量研究表明，用SPF鸡制备的IgY含量较普通商品蛋鸡高且制备的抗体更适用于治疗某些疾病，但也有研究发现，SPF鸡不仅对免疫原产生抗体，对佐剂也产生一些非特异性的抗体，故难以制备高纯度的IgY。不同日龄的鸡经免疫后IgY产生情况也不同，一般情况下，刚开产的青年蛋鸡免疫效果最好。有研究分别对140、196、270日龄的海兰褐蛋鸡用胆囊收缩素（CCK）完全抗原免疫，结果发现，140日龄的鸡产生抗体最快且效价最高 （臧海军，2007；姚康，2005；丁雪梅，2003）。

2.2 免疫程序对卵黄抗体制备的影响

2.2.1 免疫剂量 抗原剂量的高低对免疫效果有一定的影响，不同抗原的最佳免疫剂量应该通过具体试验获得。Behn等（1996）研究表明，分别给每只鸡注射0.1 mg和1.0 mg鼠IgG，结果发现，免疫剂量为0.l mg时获得的免疫效果优于1.0 mg。同时研究发现，抗原剂量在10～l000 μg时获得的免疫效果最好。王吉潭（2003）分别以0.5、1.0、1.5、2.0 mL/只免疫剂量胸肌多点免疫健康蛋鸡，结果发现，以1.0 mL/只和1.5 mL/只的免疫剂量获得的效果最好。王桂平等（2008）分别以低剂量（0.2 mg/只）和高剂量（0.4 mg/只）蝰蛇毒抗原初次胸肌免疫莱杭蛋鸡，加免时剂量分别加倍，结果发现，高剂量组获得的免疫效果比低剂量组好。杜洪桥等（2011）也得出相同结论，认为高剂量抗原免疫比低剂量免疫效果好。一般而言，抗原剂量在一定浓度范围内，免疫效果随抗原剂量的增加而加强，但抗原剂量过高容易引起动物免疫麻痹。

2.2.2 佐剂 佐剂是非特异性免疫增强剂，与抗原配合使用可增强机体对抗原的免疫应答。佐剂的类型和性质决定了免疫应答的程度和效果，选用适当的佐剂有助于产生高滴度的IgY。目前常用佐剂主要有无机铝盐佐剂、油性乳剂、脂多糖佐剂、脂质体佐剂、免疫刺激复合物佐剂、蜂胶佐剂和ASD佐剂系列等。甄宇红等（2009）以灭活金黄色葡萄球菌为抗原，分别在商品弗氏佐剂和自制弗氏佐剂配合作用下免疫蛋鸡，结果显示，商品弗氏佐剂获得了更好的免疫效果。贾莉等（2006）将猪致病性大肠杆菌菌液分别与弗氏佐剂、白油佐剂、氢氧化铝、磷酸缓冲盐溶液制成灭活疫苗免疫产蛋鸡，结果发现，弗氏佐剂苗和白油佐剂苗较后两者更能诱导产生稳定、高活性的IgY。大量研究表明，弗氏完全佐剂 （FCA）和弗氏不完全佐剂（FIA）仍是目前最有效的佐剂。FIA与FCA相比效力较低，但FCA易在注射部位发生局部组织反应，对动物组织造成损害。

2.2.3 注射途径 制备IgY时常用注射途径主要有肌肉注射、皮下注射、静脉注射和法氏囊注射等。早期研究结果显示采用皮下注射产生的抗体滴度比肌肉注射高，但目前大多数采用胸肌多点注射或胸肌和皮下联合注射的方式。有研究发现，胸肌和颈部皮下多点联合注射可获得良好的免疫效果。江青东和王慧杰（2011）用牛乳铁蛋白油乳苗免疫蛋鸡，胸肌注射4个点，颈部皮下注射1个点，结果得到了高滴度的特异性IgY。静脉注射操作难度较大，不易控制，注射时应缓慢小心避免并发症。

2.2.4 免疫次数和间隔期 免疫次数影响IgY的效价和活性持续时间，不同抗原的具体免疫次数应综合抗原类型、剂量以及佐剂等因素考虑。一般至少需要进行2次免疫，初次免疫抗原进入机体经过一段潜伏期后产生抗体，但效价低，活性持续时间短。加强免疫可促使体内产生高效价IgY，且活性持续时间长。研究表明，以人工制备的胆囊收缩素（CCK）完全抗原免疫蛋鸡，前者免疫2次，而后者免疫4次，后者制备的IgY活性持续时间明显长于前者（藏海军，2007；姚康，2005）。免疫间隔期的长短对IgY的制备具有重要影响，免疫间隔时间太短会造成免疫耐受，免疫间隔时间太长不能产生高效价抗体。有学者推荐免疫间隔期以14 d或10 d为宜，但也有研究者发现，间隔7 d也可以取的好的免疫效果。一般初免后应间隔至少14 d再进行加强免疫，以便有足够的时间产生“免疫记忆”，获得更好的免疫效果。

2.3 分离纯化对卵黄抗体制备的影响 根据 IgY不同的应用目的，采用的分离纯化方法也应不同。IgY的应用目的一般可分为口服、注射、免疫学检测等。如口服，可以将蛋黄直接冷冻或喷雾干燥制成卵黄粉饲喂动物。余冰和林晓敛（2009）在断奶仔猪饲料中添加自制的CCK卵黄抗体粉饲喂仔猪。如需注射，则需要精制IgY。分离纯化的IgY要去除脂类，避免病原微生物的垂直污染，如果卵黄中的脂类不能有效去除，将起到缓释作用，易诱发机体对IgY产生免疫应答，而且脂类易发生腐败变质，不利于保存。邵西兵（2005）将自制的抗瘦素卵黄抗体提纯制成卵黄提取液，肌肉注射粤黄后备母鸡。如将IgY应用于免疫学检测，需要纯度高，反应活性强，对分离提取的要求也更高。

3 特异性卵黄抗体在动物生产中的应用

3.1 防治动物疾病 因IgY具有耐酸碱、抗特定酶解和抵抗幼年动物的胃酸屏障等特性，故常在幼畜饲料中添加一定量的特异性IgY，以期获得有效的被动免疫效果。致病性大肠杆菌是导致仔猪腹泻的重要病原，近年来在断奶仔猪基础日粮中添加特异性IgY用于防治仔猪腹泻的研究取得了一定进展。王吉潭（2003）选用72头28日龄，平均体重为（8.5±0.1）kg 的断奶仔猪（杜×长），公母各半，随机分为4组，即对照组、普通全蛋粉组、抗K88、K99和987P高免全蛋粉组及血浆蛋白粉组，试验分为两个阶段，第一阶段分别饲喂上述4种试验日粮，试验时间为0～21 d，第二阶段全饲喂对照组日粮，试验时间为22～28 d，试验全期内，抗K88、K99和987P高免全蛋粉组和血浆蛋白粉组仔猪未出现腹泻现象，而对照组和普通全蛋粉组均有仔猪腹泻，且抗K88、K99和987 P高免全蛋粉组断奶仔猪平均日增重、饲料表观消化率与对照组相比均显著提高。许国栋（2009）将180 头（24±2）日龄三元杂交（杜×长×大）断奶仔猪，随机分为3组，试验持续28 d，0～14 d，在基础日粮中分别添加3%喷雾干燥血浆蛋白粉、1.5%普通全蛋粉、1.5%由复后FaeG-FedF融合蛋白抗原免疫制备的高免全蛋粉；15～28 d，各组饲喂相同的日粮，结果发现，试验全期内添加特异性高免全蛋粉组仔猪腹泻率极显著低于血浆蛋白粉组和普通全蛋粉组。郑爱娟等（2005）在断奶仔猪基础日粮中分别添加0.1%和0.3%的抗大肠杆菌K88卵黄粉，结果发现，与饲喂基础日粮的对照组相比，仔猪腹泻率均能显著减低。以上研究表明，特异性IgY对防治动物腹泻具有显著效果。特异性IgY经口服至肠道可附着在细菌的细胞膜上，阻止其与肠绒毛细胞上的菌毛受体结合，菌体无法黏附在肠道黏膜上而排出体外，最终导致肠道中致病性菌体减少或增殖减弱。Mahdavi等（2010）在感染大肠杆菌E.coli O78：K80的雏鸡基础日粮中分别添加0.1%、0.2%、0.4%抗E.coli O78：K80卵黄粉和0.2%、0.4%普通卵黄粉，结果发现，添加 0.2%、0.4%抗 E.coli O78：K80卵黄粉和0.4%普通卵黄粉对感染雏鸡肠道中E.coli O78：K80的增殖具有明显的抑制作用。说明特异性IgY对于防治致病性大肠杆菌具有现实可行性。

3.2 提高动物生长性能 大量研究表明，多种抗细菌或病毒的卵黄粉饲喂动物，对缓解动物病态，提高生产性能具有显著效果。王建明等（2002）研究发现，断奶仔猪基础日粮中添加0.2%卵黄抗体添加剂可有效提高断奶仔猪生长性能，试验全期平均日增重（ADG）、平均日采食量（ADFI）和饲料报酬与对照组相比都相应提高，尤其是第一周效果最明显，平均日增重、平均耗料量和饲料报酬较对照组分别提高了76.8%、14.5%和35.1%。王吉谭（2003）用含有抗K88+、K99和987 P的卵黄粉饲喂断奶仔猪，饲喂2周后发现断奶仔猪ADFI、ADG和饲料转化率（F/G）均显著提高，效果与血浆蛋白组相似。朱锦兰等（2004）将120只平均体重58.37 g的1日龄仙湖3号健康雏鸭，随机分为对照组和试验组，试验组日粮在对照组日粮基础上添加0.1%含有K88、K99、987 p大肠杆菌特异性卵黄抗体，结果发现，8～49日龄试验组ADG显著高于对照组，8～14日龄F/G显著高于对照组。李肖梁等（2006）将900只120日龄健康中华鳖随机分为3组，雌雄各半，对照组饲养基础日粮，试验组分别在基础日粮中添加2‰自制抗嗜水气单胞菌IgY和2‰自制无特异性IgY，试验过程中发现饲料中添加抗嗜水气单胞菌IgY试验组与对照组相比ADG极显著提高，平均摄食时间极显著缩短。以上研究表明，利用特异性IgY可缓解动物病态，提高动物生产性能。CCK是一种参与中枢和外周摄食调控的饱食因子，抑制胃酸分泌，降低采食量。研究发现，在动物饲料中添加抗CCK卵黄粉可提高采食量和生产性能。张晓萍（2004）在 SD大鼠饲料中分别添加 0、70、150、300mg／kg抗CCK卵黄粉，发现添加70 mg／kg抗CCK卵黄粉组SD大鼠在51～58日龄采食量显著高于对照组。臧海军（2007）研究发现，在1日龄艾维因雏鸡基础饲粮中添加80 mg／kgCCK卵黄抗体粉，其22～42日龄采食量比基础饲粮组提高1.18%。姚康（2005）研究报道，在经产母猪的基础饲粮中添加1.2%抗CCK卵黄粉，可使整个泌乳期母猪采食量提高3.8%。余冰和林晓敛（2009）在断奶仔猪基础日粮中分别添加 0、100、200、300、400 mg/kg抗CCK卵黄粉。试验全期内，ADG和ADFI均随CCK卵黄抗体粉添加水平的增加而呈二次曲线提高，且添加200 mg/kg抗CCK卵黄粉试验组效果最好，与对照组相比仔猪血清中CCK浓度下降，ADG提高12.14%，ADFI提高6.92%。某些动物因脂肪过多而口感不佳，有研究者利用脂肪细胞膜蛋白免疫蛋鸡制备特异性IgY添加到饲料中饲喂动物，降低其脂肪沉积。姜锦鹏（2006）在 27 kg左右杜×（长×梅）三元杂交商品猪基础日粮中添加75 mg/kg抗脂肪组织细胞膜蛋白卵黄粉，对照组添加75 mg/kg阴性卵黄粉，结果发现，试验组猪与对照组相比ADG提高13.03%，瘦肉率提高10.3%，背膘厚下降24.14%，并可改善肉色。提示，在育肥猪日粮中添加抗脂肪组织细胞膜蛋白卵黄粉可促进猪生长，提高瘦肉率，降低脂肪。周杰等（2011）研究也得到相似结论。

4 小结

卵黄抗体可作为抗生素替代品，防治畜禽疾病，提高生产性能，且不存在药物残留和耐药性问题。但目前对影响卵黄抗体制备的多种因素间的相关性还缺乏系统的研究，适合工业化生产且成本低、效价高、符合质量标准的方法仍是今后研究的重点。

[1]丁雪梅.胆囊收缩素主动免疫产蛋鸡的营养生理效应研究：[硕士学位论文][D].雅安：四川农业大学，2003.

[2]杜洪桥，朱蓉，徐葛林，等.鸡抗CHO细胞蛋白的IgY消长规律及其制备的试验研究[J].微生物学免疫学进展，2011，39（3）：24 ～ 28.

[3]贾莉，刘昱杉，杨严俊.K88-K99-987P和K88-K99-F41佐剂苗对鸡免疫效果的比较[J].安徽农业科学，2006，34（11）：2415 ～ 2418.

[4]江青东，王慧杰.牛乳铁蛋白卵黄抗体的制备及纯化方法的建立[J].家畜生态学报，2011，32（6）：71 ～ 73.

[5]姜锦鹏.脂肪组织细胞膜蛋白卵黄抗体对猪脂肪沉积的调控及相关机理研究:[博士学位论文][D].南京：南京农业大学，2006.

[6]李肖梁，马有智，方维焕.特异性卵黄抗体添加剂对中华鳖摄食和生长的影响[J].水产学报 2006，30（3）：426 ～ 428.

[7]邵西兵.鸡 Leptin 基因正确性的免疫验证[J].动物学研究，2005，26（2）：168～173.

[8]王桂平，廖洪映，刘新艳，等.抗蝰蛇毒卵黄抗体的制备及其免疫特性研究[J].中国热带医学，2008，8（8）：1285 ～ 1287.

[9]王吉潭.抗猪大肠杆菌卵黄抗体高免全蛋粉的研制：[硕士学位论文][D].北京：中国农业大学，2003.

[10]王建明，孙奕南，谢辛祺，等.卵黄抗体添加剂在早期断奶仔猪日粮中的应用[J].广东饲料，2002，11（6）：14 ～ 15.

[11]许国栋.日粮中添加卵黄抗体对断奶仔猪生长性能、腹泻及粪样菌群的影响：[硕士学位论文][D].武汉：华中农业大学，2009.

[12]姚康.利用抗食欲抑制因子卵黄抗体提高母猪泌乳期采食量的研究：[硕士学位论文][D].武汉：华中农业大学，2005.

[13]余冰，林晓敛.含胆囊收缩素抗体卵黄粉对断奶仔猪生产性能及养分消化率的影响[J].中国饲料，2009，1：19 ～ 25.

[14]臧海军.胆囊收缩素卵黄抗体粉在肉鸡饲粮中适宜添加量的研究：[硕士学位论文][D].雅安：四川农业大学，2007.

[15]张晓萍.胆囊收缩素卵黄抗体的生物学活性及其作用机理初探：[硕士学位论文][D].南京：南京农业大学，2004.

[16]甄宇红，金礼吉，关兴杰，等.金黄色葡萄球菌特异性卵黄抗体的制备及其影响因素[J].现代生物医学进展.2009，9（1）：53 ～ 55.

[17]郑爱娟，陈宝江，刘国华.抗大肠杆菌K88卵黄粉对断奶仔猪生长和腹泻的影响[J].饲料工业，2005，26（15）：29 ～ 31.

[18]周杰，赵茹茜，陈杰，等.不同剂量脂肪膜抗体对大鼠脂肪沉积的影响及其机制[J].农业生物技术学报，2011，19（1）：18 ～ 25.

[19]朱锦兰，李焕友，陈晓生等.卵黄抗体添加剂对肉鸭生长性能的影响[J].中国饲料，2004，21：15 ～ 16.

[20]Behn I，Hommel U，Oertel M，et al.Kinetics of IgY formation after immunisation of hens with different protein antigens[J].ALTEX.1996，13（5）：18～21.

[21]Erhard M H，Ozpinar H，Bilal T，et al.The humoral immune response and the productivity of laying hens kept on the ground or in cages[J].Alternatives to Laboratory Animals.2000，28（5）：699 ～ 705.

[22]Larsson A，Karlsson-Parra A，Sjo..quist J.Use of chicken antibodies in enzyme immunoassays to avoid interference by rheumatoid factors[J].Clinical Chemistry，1991，37（3）：411 ～ 414.

[23]Mahdavi A H，Rahmani H R，Nili N，et al.Effects of dietary egg yolk antibody powder on growth performance，intestinal Escherichia coli colonization，and immunocompetence of challenged broiler chicks[J].Poultry Science，2010，89（3）：484 ～ 894.

[24]Yokoyama H，Peralta R C，Sendo S，et a1.Detection of passage and absorption of chicken egg yolk immunoglobulins in the gastrointestinal tract of pigs by use of enzyme-linked immunosorbent assay and fluorescent antibody testing[J].American Journal of Veterinary research.1993，54（6）：867 ～ 872.