口蹄疫悬浮灭活疫苗质量控制措施

武春芳，韩四娥

(金宇保灵生物药品有限公司，呼和浩特010030)

口蹄疫是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)引起的牛、羊、猪等偶蹄兽动物的严重急性传染病，由于其传播快，给畜牧业造成了巨大的经济损失，而且严重影响国际贸易。世界动物卫生组织将其列为必须上报的疫病之一，我国农业部将其列为一类动物疫病。FMDV包括O、A、C、Asia1、SAT1、SAT2和 SAT3 共 7 个血清型，血清型间无交叉保护，造成疫病控制难度较大。口蹄疫的防控是一个系统工程，高效、安全的疫苗是防止口蹄疫疫情发生的最有效方法之一。我国多年来一直采取转瓶培养方式生产口蹄疫，该生产方式存在污染率高、收获率低等问题，对疫苗质量的控制存在一定的困难。从2009年开始，国内部分口蹄疫疫苗生产企业采用生物反应器技术进行细胞培养、病毒增殖等以来，口蹄疫疫苗质量标准(如效力评价指标)有了较大的提高，基本与世界动物卫生组织(OIE)推荐标准接轨。在此基础上，为进一步提高疫苗质量，保证免疫效果，农业部规定自2013年9月1日起，国家强制免疫用口蹄疫疫苗将逐步执行新的疫苗质量标准。

1 质量控制的意义

1.1 国家强制要求 随着国家对口蹄疫防控的重视和疫苗生产时间的延长，口蹄疫疫苗的监管制度日趋完善，管理体系已基本形成。研制环节有《新兽药研制管理办法》，注册环节有《兽药注册办法》;生产环节有《兽药生产质量管理规范》、《兽药产品批准文号管理办法》、《兽药标签和说明书管理办法》，并发布了口蹄疫疫苗相关质量标准;流通环节有《兽药经营质量管理规范》、《兽用生物制品经营管理办法》;监督环节有《兽药质量监督抽样规定》。为进一步确保疫苗质量，农业部还采取驻厂监督、飞行检查、批签发等多种日常监管方式。

1.2 企业自身要求 产品质量是企业永恒的主题，是企业一切工作的基础，是巩固和扩大市场份额的一大优势和重要法宝，是关系到企业生存和发展的头等大事。企业在追求利润最大化时，也要勇于承担社会责任，因为它可以塑造企业形象，打造企业品牌价值，从而获得长远效益。诸多事件证明忽略社会责任对企业效益的损失是无法估量的。

1.3 生物制品特殊性 由于口蹄疫疫苗本身的特性和安全防护方面的漏洞，在某些生物安全问题方面，也会出现造成不应有的损失。概括起来主要有可能对研发、生产、质检和质量监督等人员造成感染、对环境造成污染。可以说口蹄疫从研制开发到产品的应用，甚至可以延伸到应用之后的一定时期，都存在着生物安全方面的因素与风险。口蹄疫的生物安全问题直接或间接影响人类的生命健康安全，关注与重视口蹄疫的生物安全问题，不仅是提高和保障动物的健康问题，更重要的是提高与保障全人类的生命健康、促进社会的稳定问题。

2 质量控制措施

2.1 兽药GMP 我国农业部于1989年开始实施兽药GMP，规定自2005年12月31日起，未取得《GMP合格证》的企业不得进行药品生产，自2012年2月1日起，各省级兽医行政部门不再受理转瓶培养生产方式的兽用细胞苗生产线项目兽药GMP验收申请，全面GMP认证及管理升级使生产企业的工艺设备和条件有了极大地改善。

2.2 过程控制

2.2.1 原辅料的质量控制 口蹄疫疫苗生产重要原辅料有培养基、206佐剂、血清等。由于口蹄疫疫苗配制成分中有很多生物源性材料，例血清、动物源性水解乳蛋白等，所以必须要求这些产品的供货商提供外源病毒的检验报告。欧盟的1999/104/EC官方指令明确要求检测这些原料产品中是否含有牛海绵状脑病病毒[1]。生物制品在接种后引起的不良反应中，有相当比例是由于生产过程中使用的原辅材料所致。根据原辅料的使用情况增加相应的检测项目，如微生物限度、热原检查、细菌内毒素检查等生物安全性质控项目，以进一步确保使用的安全性。因此，在疫苗制备中原辅料成分不再被看作是无活性的物质[2]，生物制品生产用原辅料的理化性质和安全性对生物制品的有效性和安全性有着直接的影响。《中国兽药典》二O一O年版三部新增血清及活疫苗外源病毒检验项目，并通过组织培训、专项检查、座谈等多种形式进一步落实该项工作，足见其重要性。

2.2.2 细胞与病毒培养工艺的质量控制 相对转瓶培养时代，口蹄疫悬浮培养在对传统工艺的革新与发展，主要的三个关键控制点，其一是对培养基的优化，细胞由贴壁生长方式转变为悬浮生产方式，这就需要选择个性化的培养基，满足其生产要求，并不断对原有细胞株进行适应性培养驯化后，进行逐级放大培养;其二是悬浮培养过程的优化，如培养的转速、温度、溶解氧浓度(DO)、pH值、细胞接种密度、细胞活力(大于等于95%)等指标，通过细胞倍增时间和细胞计数来评估细胞培养质量，控制接毒时间(达到2×106个/mL);其三是反应器的优化，目前生物反应器能够进行实时监测和控制的参数有温度、搅拌转速、DO和pH值等物理环境参数，而如在线灭菌系统(SIP)自动灭菌与定位清洗(CIP)清洗的全自动生物反应器、生物反应器的自动取样与分析系统等，一些重要器件如耐高温灭菌的隔膜阀的抗疲劳、抗膨胀性以及器件加工工艺与标准都需进一步优化;供氧方式、搅拌方式、热传递也需进一步探索。

2.2.3 纯化浓缩工艺的质量控制 口蹄疫灭活疫苗诱发有效的免疫应答，通常需要较大量的抗原，而疫苗中的非病毒蛋白可引起免疫副反应，另外，伴随病毒增殖而产生的病毒非结构蛋白对于感染动物的甄别亦带来困难。因此，在灭活疫苗特别是多价苗生产中，为了保证免疫效果，降低疫苗使用剂量，减少接种引起的有害反应，利于病毒抗原和成品苗的贮存，便于免疫和感染的鉴别，就必须对病毒抗原进行浓缩纯化。现在常用于大规模生产的纯化浓缩方法是超滤和沉淀法，聚乙二醇6000(PEG 6M)或聚环氧乙烷(PEO)不仅可以达到理想的浓缩倍数，还可大大降低抗原收获物中非病毒蛋白成分及含量。目前，在生产中用切向流超滤装置或中空纤维过滤系统或震动筛进行浓缩[3]。然而，过滤材料的载流量小于等于100 ku时纯化效果不好，而大于200 ku时146S的损失又大[4]。使用PEG纯化时，能够充分的去除来源于BHK21疫苗中引起过敏反应的物质。沉淀的抗原用低速离心法获得，也可用助滤剂进行沉淀抗原的过滤，如钙化的硅藻土，比离心法方便的多[5]。灭活抗原也能用PEO沉淀法有效地沉淀。PEG沉淀可充分除去变应原成分，PEO可使FMDV浓缩达1000倍，从病毒收获物中最少除去95%的杂蛋白质[6]。我国口蹄疫生产企业对灭活抗原进行一系列澄清、浓缩与纯化工艺处理，有效去除了各类非抗原蛋白和其他杂质，确保了疫苗的效力和高安全性。

2.2.4 检验过程的质量控制 口蹄疫的各项技术检测指标在严格执行《规程》的情况下，重点进行了几项检验。采用蔗糖密度梯度法对FMDV抗原进行146S测定，实现了定量添加抗原，改变疫苗质量控制以“定性而非定量”的方式，确保了疫苗效力;采用凯氏定氮法对疫苗中杂蛋白含量进行定量检测，实现了对疫苗有效成份的客观评价;口蹄疫外壳蛋白大约为29 kD，按变性聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)条带方法实现了对疫苗有效抗原和杂蛋白含量进行简便的评价;按照《中华人民共和国兽药典》二部细菌内毒素检查法对整个工艺进行内毒素的控制。

2.2.5 生产过程的质量监督 质量活动必须贯穿于整个生产过程，以得到符合既定质量标准的产品。口蹄疫疫苗生产从原料的进厂到生产后检验合格放行，涉及到许多工序和环节，在每个环节都必须把好质量关，才能最终保证产品质量，任何一个环节的疏忽，都有可能导致产品质量的不合格。因此，口蹄疫疫苗生产企业应当根据自身产品的特点制订合理的产品工艺，并结合设备特点制订相应的岗位标准操作规程，明确生产流程和重点工序质量监控点，分工明确，要通过对生产过程的监督和控制来保证产品的质量。通过全员参与和有效的预防来减少生产过程中差错和污染，从而减少质量事故的发生。

3 展望

2013年6月13日农业部发布《关于做好口蹄疫疫苗质量标准提升工作的通知》，明确指出，在现有口蹄疫疫苗质量标准的基础上，提高效力检验标准，增加内毒素和总蛋白检测参数:2013年9月1日起，新生产的口蹄疫灭活疫苗及合成肽疫苗效力检验标准由每头份3 PD50提高到6 PD50，新生产的口蹄疫灭活疫苗内毒素每头份疫苗不超过50 EU;口蹄疫灭活疫苗总蛋白检测参数分两个阶段实施，自2014年1月1日起，对总蛋白含量实施不定期抽样检测，并公开检测结果，2015年1月1日起，总蛋白含量每毫升疫苗不高于500 ug。农业部在提高口蹄疫疫苗抗原含量和内毒素检测标准的基础上，2015年开始将进一步提高杂蛋白检测标准。目前我国兽用疫苗中强制免疫苗品种较少但所占比重较大，而畜牧养殖规模化、现代化将推动整个行业需求结构调整，向品质化、多样化方向发展。随着上游畜禽养殖规模的稳定增长，必须免疫的强制免疫苗的需求将稳中有升，同时相关产品的毒株改良、佐剂改良、工艺改进(如悬浮技术的普遍使用)、质量提升将是大势所趋。由于我国强制免疫疫苗生产厂家数量较多，其在生产设备、技术力量、工艺水平等方面差别较大，国家采购标准的提高将加速行业优胜劣汰，有利于优势企业市场集中度的提升。预计除口蹄疫疫苗外，未来高致病性禽流感、猪蓝耳疫苗等其他强免疫苗的政府采购标准都有望进一步提高。

[1]张怀宇，王泰健，赵启祖.口蹄疫灭活疫苗质量控制和检测技术的研究进展[J].兽医导刊，2007，3:25-27.

[2]陈瑞爱，装仇福，何 芳.高致病性蓝耳病灭活疫苗的质量控制[C]//兽医生物制品学 兽医微生物学学术论坛论文集:湖北，2008:405-407.

[3]卢永干.我国口蹄疫灭活疫苗生产工艺的技术进步[C]//第11次全国口蹄疫学术研讨会论文集:辽宁大连，2007:948-950.

[4]Barteling S J.Development and performance of inactivated vaccines against foot and mouth disease[J].Rev Sci Tech，2002，21(3):577-588.

[5]Barteling S J.Foot and mouth disease vaccine production and research in the Netherlands[J].Vet Q，1987，9:5-15.

[6]张淑刚，张永光.口蹄疫灭活疫苗研究进展[J].动物医学进展，2008，29(12):43-47.