股骨头坏死动物模型研究进展

2013-01-24张成龙章建华

中国比较医学杂志 2013年3期

张成龙，尹华，章建华

(1.浙江中医药大学药学院，浙江杭州 310053;2.浙江中医药大学附属第一医院，浙江杭州 310006)

股骨头缺血性坏死(osteonecrosis of femoral head，ONFH)是由于不同的病因破坏股骨头的血液循环造成骨细胞、骨髓造血细胞和脂肪细胞坏死的病理过程，最终导致股骨头塌陷，髋关节功能障碍的一种疾病［1］。近年来发病率不断增高，发病年龄趋于年轻化，因其临床症状较重、致残率高，治疗困难，越来越引起医学界的重视，其中激素性股骨头坏死占总发病率的50%以上，并呈逐年上升的趋势。

ONFH按照病因分类可分为创伤性股骨头坏死及非创伤性股骨头坏死。创伤性ONFH主要见于髋部创伤，如:股骨颈骨折、股骨头骨折、髋关节脱位、髋臼骨折等，股骨头由于血运中断而发生坏死。非创伤性ONFH主要是由于激素滥用、饮酒过量、风湿病、血液病等引起。

正因为股骨头坏死的发病机制并不明确，且缺乏切实有效的早期治疗方法，所以建立与人类临床病理特征相似的股骨头坏死动物模型以研究其发病机制及寻求有效的治疗方法显得尤为重要。现就目前股骨头坏死动物模型建立的研究进展综述如下。

1 模型动物的选择

国内外学者的研究中，选择用来建立股骨头坏死动物模型的动物包括四足类动物(如大鼠、兔、犬、猪、羊、马)和双足类动物(鸡、鹅、鹋鸸)。

双足类动物的特点是双下肢负重，与人类的负重方式相似，突出生物力学在ONFH病程中的作用。鸡的股骨头坏死的进程与人类相似，病理变化接近人类。曾有国内外学者应用鸡、鹋鸸建立激素性股骨头坏死模型［3－4］。但是鸡与人类的亲缘性较远，人们对其解剖学及生理学上的认识较少。且鹋鸸来源有限，饲养难度大，限制了其广泛应用。

应用于ONFH造模四足类动物多属哺乳类动物，生物进化上与人类较近。应用最多的是大鼠、兔和犬。其中大鼠的骺生长板终生存在，常用来制作儿童股骨头骨骺坏死(Perthes'病)动物模型;自发性高血压大鼠(SHR)易患多种骨骼疾病(包括ONFH)，可以模拟Perthes'病的自然病程;大鼠没有呕吐反射，用作灌胃法制作酒精性 ONFH模型，剂量确切;大鼠也用作激素性 ONFH模型建立，马信龙等人［5］尝试 Wistar大鼠臀肌注地塞米松磷酸钠20mg/kg，每周1次，并每天辅以强制活动，8周后造模成功。用兔作ONFH模型的研究也较多，特别是用作激素性股骨头坏死模型［6－10］，但兔在病程上与人类激素性股骨头坏死病程不符，病理变化差别大;犬的体形较大，较适合于外科手术建模［11］。羊的长骨粗大，脂肪丰富，易于发生减压性骨坏死，是制作减压性骨坏死动物模型的最好动物［12］。猪和马作为实验动物建模的相对较少［13］。同时由于猪、羊等大动物成模时间长，实验成本高，成功率较低，死亡率高，较少应用于实验室研究。

理想的股骨头坏死动物模型首先要求实验动物要与人具有较好的亲缘性及相似性，所选动物的解剖和生理学特点尽可能与人类相似，符合人类ONFH病变规律，即从早期的病理组织学改变到晚期的股骨头塌陷，股骨头坏死区域应接近软骨面并与周围活骨相连接，且在坏死修复过程中股骨头应承载正常的应力;可重复性好，便于检测评价;经济可行。

2 造模方法

2.1 激素造模

从20世纪已经有学者用不同方法建立激素性股骨头坏死模型。

2.1.1 单纯激素诱导:赵广辉等人对新西兰大白兔进行每周2次的臀肌注地塞米松磷酸钠(8mg/kg)，分别于3周、6周后观察到股骨骨密度及组织病理学上的软骨改变［14］。据赵金东等人研究，用40mg/kg甲基强的松龙臀肌注中国大耳白兔造模，8周后模型建立成功［15］。研究报道也有学者选择SD大鼠造模，每周2次臀肌注醋酸泼尼松龙(24.5 mg/kg)连续6周，大鼠股骨头骨小梁模糊，空骨陷窝率明显升高［16－17］。

2.1.2 激素联合马血清诱导:模拟临床上高免疫状态下大剂量使用激素造成的股骨头坏死。王伟等人应用马血清10 mL/kg，经兔耳缘静脉注射3周后，减量为6 mL/kg再次注射2周后，腹腔注射甲基强的松龙，按45 mg/kg连续3天，每天注射1次，可造成激素性坏死模型［18］。

2.1.3 激素联合内毒素诱导:模拟高凝血状态下使用激素导致的股骨头坏死。童培健等人［19］选用Wistar大鼠，腹腔注射内毒素 20 μg/kg两天，臀肌注甲强龙40 mg/kg三天，6周后组织病理学观察结果显示，模型组坏死率达70%。黄克勤等［20］研究发现，SD大鼠尾静脉注射内毒素10 μg/kg 1次，肌注20 mg/kg甲强龙4天，6周后模型建立成功。据赵金东等人［21］研究报道显示，对中国大耳白兔进行耳缘静脉注射内毒素(50 μg/kg)两天后臀肌注甲强龙(40 mg/kg)三天，4周后 MRI扫描，造模组兔T1WI表现为右侧股骨头信号减低，组织病理学观察发现模型组骨小梁数目明显减少，断裂，但模型组动物死亡率较高。

激素造模法的应用越来越广泛，但在各家报道中，建立ONFH动物模型所用激素的类型，剂量以及致ONFH发生率均不同。对激素剂量的研究方面目前还没有大量的实验数据证明ONFH发病的最佳用药剂量，同时针对内毒素、激素的用量过大导致的动物死亡这方面的文献报道也不多。因此对激素类型、用量的考察对于完善激素性股骨头坏死动物模型的建立有着重要意义。

2.2 酒精造模

过度的酒精引起肝的损害，脂肪肝又产生了脂肪栓子。脂肪栓子对非创伤性骨坏死起关键作用［22］。郭天明［23］曾用雄性 Wistar大鼠每次以 56度白酒灌胃(10 mL/kg)连续两天后停一天，持续24周后，血液生化指标显示 HDL-C、LDL值均较正常组低;组织病理学显示部分骨小梁出现空骨陷窝，多于50%。齐振熙等［24］对SD大鼠给予56度白酒8 mL/kg·d(含纯酒精约 4 g/kg·d)灌胃，20 周后处死动物进行组织病理学观察，发现实验组股骨头软骨层较薄，软骨下骨小梁变细，间距增大，结构紊乱，骨小梁有断裂。

酒精性股骨头坏死模型的建立主要问题在于灌胃剂量的选择及造模时间。在大鼠能耐受的情况下，应尽可能采取大剂量和高频度灌胃。但在保证实验大鼠不发生酒精中毒致死的情况下，造模时间仍然较长，增加了饲养的难度。

2.3 创伤性造模

成年创伤性股骨头坏死动物模型的制备有液氮冷冻法、手术破坏骨髓法、选择性血管结扎法、局部细胞灭活法等。

2.3.1 液氮冷冻法:有学者用液氮冷冻法造成犬整个股骨头坏死及修复反应，但坏死由外向内，且一周后即出现股骨头外形改变和骨性关节炎［25－26］。但液氮冷冻法造成的动物股骨头坏死模型的骨坏死与临床有一定的差别，对临床的指导有很大的局限性。

2.3.2 手术破坏骨髓法:李印良等［27］通过将兔圆韧带切断，在近股骨附着点处环形切断结扎关节囊，股骨颈基底部钻直径2 mm骨孔，破坏骨髓的方法制作股骨头坏死模型。此方法造成缺血性坏死缺点是手术创伤大，坏死的修复可能会受到多方面因素的影响，修复时间较长，不利于短期内观察其完整的修复过程。

2.3.3 选择性血管结扎法:Nakamura等［27］结扎狗股骨头周围血管，并使髋关节后脱位9 h，术后3 d、1、2、4周进行 MRI及组织切片观察，组织切片3 d开始出现异常，MRI 1周开始出现异常。动脉和静脉的结扎虽然能引起骨坏死，但造模时间长，骨的修复较为明显，造成的模型往往不典型。

2.3.4 局部细胞灭活法:彭吾训等［28］将微波天线插入兔股骨头进行微波灭活，1、2、4、8和12周后利用X射线、MRI检测股骨头影像。55℃，10 min微波灭活后，4周时坏死与修复同时进行，8周时坏死骨小梁及骨髓组织完全吸收，12周时骨修复停止，骨坏死继续，股骨头开始塌陷。杨明亮等［29］则利用家兔股骨头内注射盐酸、氢氧化钠的方法造模，6周左右即可出现典型的骨坏死。但灭活法与人类临床的发病过程不一致，对于临床股骨头坏死病程发展及治疗方法研究指导意义不大。

3 ONFH动物模型评价指标

在股骨头坏死的实验研究中，判定动物模型是否复制成功，是至关重要的一步。对模型的评价指标有以下研究:

3.1 大体观察及X线片

已造成股骨头坏死的模型股骨头松脆，易于剖开凿切。X线往往显示股骨头周围骨质变疏松，骨皮质变薄，骨小梁模糊不清或消失，股骨头内有散在低密度区的表现。但此项指标不适用于早期股骨头坏死的诊断。

3.2 组织形态学检查

贺西京等［30］于光镜下观察了坏死的股骨头组织，发现第4周开始，软骨下骨区骨小梁部分骨细胞核固缩，胞核较小，染色深，空缺骨陷窝数增多，透射电镜下观察到较多的骨细胞发生核固缩及骨细胞破裂成碎片，出现了股骨头骨细胞的坏死。本课题组经过前期的实验研究发现，股骨头坏死大鼠股骨头表面出现不平整，骨小梁结构出现紊乱，甚至断裂现象，骨髓腔内脂肪细胞逐渐增大。由于骨坏死的确诊标志是骨和骨髓死亡的组织学证据，所以此项指标被广泛采用。

3.3 血生化测定

生化测定是对骨坏死的一种定量分析。学者在研究股骨头坏死过程中，发现模型组动物涉及到脂代谢的各项血脂指标，包括总胆固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、低密度低蛋白(LDL)、极低密度脂蛋白(VLDL)、高密度脂蛋白(HDL)、血浆脂联素含量与正常组动物有显著性差异［31］。本课题组研究发现，股骨头坏死动物的血清P含量均较正常组低、血清Ca含量则无显著性差异，这可能与骨中钙元素的融出有关。目前尚无对动物股骨头坏死进行分期的统一标准，单独依靠血生化的指标来评价股骨头坏死模型复制成功与否是不全面，亦是不合理的，血生化指标的测定与组织形态学等其他指标结合的方法可作为参考，有助于判断骨坏死的程度。

3.4 骨生物力学、骨Ca、P和骨密度

根据股骨头坏死的综合分期，在骨坏死早期，会出现轻微的骨质疏松，整个股骨头坏死的发病期间经历一个共同的骨质疏松的病理过程［1］。在股骨头坏死动物模型中，利用骨生物力学中股骨弯曲载荷值、单位面积最大载荷量、弹性模量的测定［32］，可以显示出坏死动物股骨脆性明显增加，骨质明显疏松。骨中的 Ca、P是骨矿物质的主要成分，股骨中Ca、P含量的高低是衡量骨质的一个非常重要标志。Ca、P含量低，说明骨质松脆，反应在骨生物力学上的各项评价指标更加明显。骨密度，是骨质量的一个重要标志，反映骨质疏松程度。也曾有学者［33］研究发现股骨头坏死的新西兰大白兔骨密度比正常组明显偏低，有非常显著性的统计学差异。因此骨生物力学、骨 Ca、P及骨密度可作为股骨头坏死动物模型建立成功的间接性评价指标。

3.5 股骨头血管造影

王锐英等［34］认为血管造影可用于股骨头坏死的早期诊断。股骨头血管密度最低生理限度是多少，破坏或减少到何种程度可产生不可逆损害，可作为早期诊断股骨头坏死的标准，尚有待进一步研究。

3.6 骨内压

文献早有报道骨内压与骨坏死的密切关系，在股骨头坏死的早期，骨内压就有明显的增高。曾有研究者采用测量骨内压的方法，早期诊断股骨头坏死，准确率高［35］。因此，骨内压也被认为可以用作于间接判断股骨头坏死模型是否成功。

综上所述，复制股骨头坏死动物模型的方法很多，但是由于 ONFH的发病机理尚未完全明确，以及人和动物在生理解剖上存在的差异，现今还没有一种公认的方法可以完全复制与人ONFH自然病理过程相一致的动物模型。近年来由于我国临床上激素应用的增多，由于滥用激素引发的激素性股骨头坏死发病率也逐年增高，应当提高对激素性股骨头坏死的重视。目前国内外学者对于激素性股骨头坏死动物模型的研究越来越多，但应用于造模的激素类型种类繁多，激素应用剂量也不尽相同，甚至有的学者在不同的造模动物之间采用体表面积换算的方法确定造模剂量。另外关于高剂量激素引起的动物死亡率问题没有很多文献报道，能够使ONFH模型复制成功的最佳激素剂量亦尚无学者做过相关研究。另外在评价模型成立与否的评价指标方面，许多文献研究中所选用的检测指标也有待商榷，如血清钙、血清磷含量，血脂等。在前期课题组的研究中发现血中的钙、磷含量变化可能与骨头中的钙、磷元素的融出有关，而血脂的变化受多种因素的影响，不宜将其作为评价股骨头坏死的特异性指标。因此还需进一步确定更为直观、更能反映骨坏死本质的评价指标。综上所述，对激素类型、剂量的考察以优化激素性股骨头坏死动物模型的建立，以及形成合理、系统的评价体系应当是今后股骨头坏死动物模型领域研究的重点内容。

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