黑安格斯牛超数排卵试验效果分析

2013-01-23冯亚杰王二耀施巧婷辛晓玲魏成斌楚秋霞王治方徐照学

中国牛业科学 2013年2期

冯亚杰，吴姣，王二耀，施巧婷，辛晓玲，魏成斌，楚秋霞，王治方，徐照学

黑安格斯牛源于英国的安格斯郡，以此得名。该牛体躯宽深，呈圆筒形，四肢短而直，前后挡较宽，全身肌肉丰满，出肉率高，肉质好，肌肉大理石纹明显并具有耐粗饲，饲料报酬高等优点。我国许多地区于上世纪80年代就开始引进安格斯肉牛用于本地牛的杂交改良，经多年研究表明其杂种后代具有极强的适应性和良好的发育性能。近年来随着我国对优质牛肉需求量的增多，安格斯肉牛将成为极具商品价值的优良品种。笔者于2011年4月份至5月份选择黑安格斯母牛做为供体牛进行了超数排卵及胚胎移植的试验，目的是为利用胚胎移植加速该品种快速扩繁的相关研究和应用提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供体牛和受体牛的选择及饲养管理挑选卵巢机能正常且无生殖道疾病的黑安格斯母牛为供体牛，年龄在3～4岁，营养中上等。挑选供体的同时注射维生素ADE 10mL，以后在原有的饲养基础上，每天增喂精料1kg，自由采食及饮水。

在同一养殖场挑选卵巢机能正常且无生殖道疾病的西杂牛为受体牛，年龄在2～3岁左右，营养中等。在原有的饲养的基础上，每天增喂精料1kg，自由采食及饮水。

1.1.2 药品和器材进口FSH（加拿大，规格400 mg／瓶）；前列腺素D－PG（上海计划生育研究所生产，规格0.15mg／支）；阴道埋植栓（CIDR，新西兰生产）；促性腺激素释放激素（GnRH，上海计划生育科学研究所生产，规格200mg／支）；维生素ADE注射液；杜氏磷酸盐缓冲液（D－PBS，购自美国Gibco公司）；体视显微镜（尼康SMZ645）；胚胎采集及移植器械（购自日本富士平工业株式会社）。

1.2 方法

1.2.1 供体牛超排处理方法与程序供体牛超排处理采用CIDR＋GnRH＋FSH＋PG方法。于供体牛阴道内放置CIDR（记为第0d），第7d肌注Gn－RH 100mg，第10d开始递减法注射FSH，每隔12 h注射一次，连续注射8次，总剂量为340mg。在第1次注射FSH的同时注射维生素ADE 10mL，在第6次和第7次注射FSH的同时注射前列腺素D－PG 0.15mg，第7次注射FSH的同时去掉CIDR，撤栓后24h开始观察发情，每隔6h观察一次，记录发情准确时间。母牛发情后第12h开始输精，第一次输精后12h再次输精一次，每次输2支进口安格斯细管冻精。输精后间隔7d开始非手术法冲胚。

1.2.2 受体牛同期发情受体牛同期发情处理采用CIDR＋PG方法。在供体牛放置CIDR的当天，受体牛阴道内放置CIDR，放栓当天定为0d，放栓后的第13d，肌肉注射前列腺素 D－PG 0.15mg，观察发情，记录时间。

1.2.3 胚胎移植在实体显微镜下捡出胚胎，根据形态学标准［1］将胚胎分为 A，B，C，D级，其中 A，B，C级胚胎可用于胚胎移植。移植方法如下：保持无菌状态下将装有胚胎的细管装入移植枪，套上硬外套、软外套，移植前，在受体牛荐尾结合部硬鞘膜外腔内注射5%的普鲁卡因5mL麻醉，高锰酸钾清洗外阴，用无菌纸擦拭干净，直肠把握法将胚胎输入具有A等级或B等级的黄体一侧的子宫角小弯处。

2 结果

2.1 超排效果

本次共选择9头青年纯种黑安格斯牛进行超排，共冲出胚胎84枚，其中可用胚胎69枚。其中A级胚胎48枚，B级胚胎14枚，C级胚胎7枚，不可用胚胎15枚。收集胚胎为9.3枚／头，平均每头获得可用胚胎数为7.6枚／头。

2.2 受体同期发情效果及胚胎移植妊娠率

本次共选择85头西杂母牛进行同期发情处理，发情72头，同期发情率为84.7%。受体经黄体检查评定后可用56头，受体利用率为77.7%。实际鲜胚移植56头受体牛。3个月妊娠检查有31头怀孕。妊娠率为55.4%。

3 讨论

3.1 影响超排的因素

牛的超数排卵是一个复杂的生理过程，同时受到季节、年龄、胎次、环境、营养状况和激素等诸多因素影响［2－7］。季节选择在春季和秋季效果较好，有结果表明，头均可用胚胎数量3月份最高，8月份最低，两者间差异显著［8］。因此选择在气候适宜牛生理状态的季节进行超排效果较为理想。不同年龄段以3～6岁的供体超排效果较好，经产牛的效果好于青年牛［9］。舒适的环境和营养状况良好的供体也是影响超排效果的重要因素，减少对供体的应激并保持正常能量摄入可以提高可胚胎的数量和质量。有研究表明［10］：适当补加饲料，超排效果会显著提高，而且胚胎发育良好，A、B级胚胎比例高。这些文献报道说明在超排试验中的前期准备工作是不可忽视的，因此尽量减少各种不利因素的影响是取得满意的效果的保证。

在激素使用方面，目前报道对牛超排使用过的促性腺激素有三类：FSH（卵泡刺激素）、PMSG（孕马血清促性腺激素）、hMG（人绝经后促性腺激素）。而在相关文献报道中很少使用PMSG和hMG，因为PMSG在牛体内的半衰期太长，从而引起对卵巢的持续刺激，会出现不排卵和胚胎质量降低等现象［11］。而hMG的价格较贵且有文献报道其超排效果与FSH基本一致［12］。因此FSH仍是目前最常用的激素。对于FSH的选择上，激素质量稳定性是影响超排效果的关键，是直接决定胚胎数量与质量的重要因素。王军［13］选用国产FSH和进口FSH对西门塔尔牛进行超排的试验结果表明，进口FSH所获得的胚胎数及可用胚胎数均明显高于国产FSH。冯建忠［14］、李铭［15］、秦殿武［16］等亦有类似结论的报道。因此本次试验也采用加拿大FSH对安格斯母牛超排，在340mg的剂量下，收集胚胎为9.3枚／头，平均每头获得可用胚胎数为7.6枚／头。超过国际胚胎协会报道的平均水平［17］。

3.2 GnRH和维生素ADE对胚胎质量的影响

GnRH及其类似物是一种调节生殖的神经激素，能够促进垂体释放促性腺激素，通过影响LH释放，促使LH的分泌。所以在超排过程中通过配合GnRH，可以提高超排牛血液中LH水平，与外源性FSH共同作用，使多个卵泡同时发育，并间接促进卵泡破裂排卵，改善超排效果。另外GnRH可能还具有改善超排牛输卵管及子宫环境的作用，有利于胚胎的正常发育，提高胚胎可用率［18］。在本研究中，获得的正常胚胎率为82%，与乔海生［19］报道的相一致，证明GnRH和FSH配合使用提高可用胚胎率的效果是可靠的。维生素ADE属于牛体内不能合成的外源性维生素，维生素A可以维系上皮组织的完整性，当维生素A缺乏时，引起卵泡上皮细胞变性而形成卵泡闭锁或囊肿。维生素D对钙盐和磷盐的代谢有密切关系，钙磷缺乏时，可以影响卵巢的机能，阻碍卵泡的发育。维生素E可促进性激素的分泌，调节卵巢的发育。本研究中在超数排卵时注射维生素ADE后，A级胚胎获得比率为69.6%，这与曾滔［20］报道使用维生素ADE获得的A级胚胎明显高于未使用的对照组所得结论基本一致。说明在供体超排处理时适当注射维生素ADE，对于提高胚胎的质量还是有利的。

3.3 受体的同期发情和胚胎移植妊娠率

目前同期发情处理方法有一次PG法、二次PG法、CIDR＋PG法。有文献报道［21］，经CIDR处理高于一次PG处理的受体利用率，两者差异极显著。其原因是放置CIDR使母牛维持较高浓度的孕酮水平，由于有高水平孕酮的存在，可使氯前列烯醇溶解黄体很彻底，使发情集中，黄体同期化程度高。而单纯注射氯前列烯醇作用较单一，发情较分散、黄体同期化程度较低，影响了移植妊娠率。虽然二次PG法比一次PG法的同期性更好，但操作周期太长，如果高百分比的母畜未处在发情周期，可导致很低的受孕率。因此，CIDR＋PG这种方法是目前最常用的处理方法而且移植利用率较高。

对于移植受体来说，除了考虑生殖系统方面的因素，受体的营养状况越来越引起人们的重视。如果受体牛缺乏营养，卵巢会处于静止状态，形成黄体的质量较差，不利于胚胎的着床［22］。周顺成等［23］报道营养是影响家畜黄体形成的主要因素，何光中［24］等对比对营养不足的黄牛进行补饲和不补饲，结果表明补饲组黄牛发情率和移植妊娠率明显大于不补饲组。因此，挑选营养状况良好的受体，以及在胚胎移植前后的饲养管理是影响妊娠率的关键，特别是移植后的胚胎着床和发育阶段。另外，季节也是影响胚胎移植妊娠率的一个因素，要避开过热和过冷温度对牛造成的应激，胚胎移植就会得到一个较高的受胎率，因此春季和秋季是进行胚胎移植的最佳季节，此时会得到较高的受胎率［25］。

［1］Overstrom E W.In vitro assessment of embryo viability［J］.Theriogenology，1996，（45）：3－16.

［2］王建辰，章孝荣.动物生殖调控［M］.安徽科学技术出版社，1998，231－280.

［3］郭志勤，张沅，陈东，等.家畜胚胎工程［M］.北京：中国科学技术出版社，1998，1－6.

［4］孙凤俊，张新慧，等.奶牛超数排卵技术研究进展［J］.中国奶牛，2007，35（1）：26－28.

［5］李剑军.影响超数排卵的主要因素［J］.黄牛杂志，1998，24（4）：46－47.

［6］张磊，冉汝俊.家畜超数排卵和胚胎移植的影响因素［J］.中国草食动物，2000，2（4）：34－37.

［7］杨利国主编.动物繁殖学［M］.北京：中国农业出版社，2003，326－327.

［8］朱玉林，赵俊金.高效率超数排卵对供体奶牛的基本要求［J］.北京奶牛，1997，（4）：5－5.

［9］李建栋.浅析影响奶牛超排效果四项因素的研究［J］.养殖技术顾问，1997，25（3）：6－9.

［10］陈亮.营养水平对延边牛超排及胚胎质量影响的研究［C］.中国畜牧兽医学会兽医产科学分会第五届全体会议第十次学术研讨会论文集.2009，156－161.

［11］Armstrong D T.Factors affecting superovulationsuccess［J］.Embryo Transfer Newsletter，1991，（9）：11－17.

［12］张华林，杨利国，等.HMG和FSH用于安格斯牛超数排卵的效果比较［J］.中国奶牛，2012，30（1）：17－20.