牛胚胎移植技术操作流程及应用前景

豆晓丽，樊天喜

牛胚胎移植技术充分挖掘优秀母畜的繁殖潜力，同时在加快遗传进展、增加肉用畜种的双胎率、克服母畜不孕症、降低引种费用、减少疾病传播等方面具有重要价值。牛的胚胎移植过程大致可分为以下几个环节：同期发情→超数排卵→胚胎采集→胚胎检测→胚胎保存→胚胎移植。只有严格把握各个操作环节技术要领，才能获得满意的结果。

1 同期发情

1.1 供体、受体母牛的选择

1.1.1 供体母牛的选择 供体应是良种，而且性状表现优秀，具有较高育种价值与遗传优势的个体，生产性能高、遗传性稳定、系谱清楚、体质健壮、繁殖机能正常、无遗传和传染性疾病、年龄在2周岁到7周岁以内、产犊在3个月以上，6个月以内的母牛。必须严格掌握发情时间和前两个发情周期，不能改变饲养环境条件，如长途运输，饲养成分等。

1.1.2 受体母牛的选择 受体牛仅作为借腹怀胎，不要求遗传性状，但发情周期必须正常，年龄在2周岁到5周岁以内，健康状况良好，不能有任何影响繁殖性能的疾病，尤其是生殖器官正常。

1.2 供、受体同期发情

要求受体和供体的发情时间要相同或相近，前后差异不超过1d，故对供、受体进行同期发情处理。同期发情常用 PMSG、GnRH、FSH、LH、hCG、P4等［1］外源性激素对牛只进行处理，达到发情和排卵的时间同期化的目的。目前，生产中常用的是氯前列烯醇（PGC），其溶黄体的生物活性相当于PG的200倍，相当于15－甲基前列腺素的10倍以上，由于其效果确实，价格低廉，使用方便，广泛应用于家畜同期发情，牛的用量一般为0.3mg［2］。

2 超数排卵

2.1 处理牛选择

超排处理时选择母牛上次发情周期9～12d进行，发情时要注意跟踪直肠检查，确定黄体数、级别、卵泡数等，判断黄体的位置及数量与卵泡的数量及位置是否一致。超排开始时要停止直肠检查。超排时所用药物剂量要因牛而异。对选择好的供体牛于上次发情周期的9～12d开始超排处理。

2.2 超数排卵方法

将30mgFSH溶解于10mL30%PVP（聚乙烯吡咯酮）后，在供体牛发情后第9～13d一次性注射。朱华彬等指出，用30%的聚乙烯吡咯酮溶解后，FSH在牛体内的半衰期为3d，因此可以一次肌肉注射给牛超排，既简化超排程序，又能提高超排效果［3］。

3 胚胎采集

供体受精日计0d，输精第6d或第7d采集胚胎。首先将牛保定，保定架前高后低（相差20cm），然后用2%普鲁卡因2～5mL在第一与第二尾椎间隙部位进行尾椎硬膜外腔麻醉。麻醉后消毒外阴，用子宫扩张棒扩张子宫颈，清除宫颈粘液。采取二通管正压冲卵［4］，即将插有内芯的冲卵管插入一侧子宫角，在达到子宫大弯时，助手协助拔出内芯5～10cm，直到冲卵管达到子宫角首段为止，给二通管内充气10～20mL，最后拔出内芯。操作者握住子宫输卵管结合处，每次宫注液量依子宫大小而定，每侧宫角冲洗6～7次。

4 胚胎检测

检查的过程中一般先将冲胚液静置30min，然后放于实体显微镜下放大16倍寻找胚胎。根据平皿的形态可以从上到下，从左到右，从外到内螺旋形依次移动，将找到的卵用吸管吸出放入装有PBS的保存液滴中，然后吸些PBS吹向卵周围，使卵在液滴中翻腾，以便清除胚胎周围的粘连物。将净化后的胚胎置于PBS液中，然后放在40～200倍显微镜下作形态学检查。研究证实，胚胎内活细胞数的多少与之妊娠率成正比例。一般按质量把胚胎分为A、B、C、D四个等级。胚胎与发育期相吻合，卵裂球轮廓清晰，透明度适中，细胞密度大，卵裂均匀，无水泡样裂球，无变性细胞，即为优秀胚，定为A级；与典型的胚胎相比，稍有变形，但卵细胞和分裂球的轮廓清晰，细胞质较致密，分布均匀，变性细胞和水泡不超过10%～30%的定为B级；凡形态有明显变异，卵细胞和分裂球轮廓稍不清晰，或部分不清晰，细胞质不致密，分布不均匀，色调发暗，突出的细胞、水泡和变性细胞占30%～50%的胚胎定为C级；凡总体形态结构不正常的卵子、未受精的退化或破碎卵子，透明带空的或将空的卵子，以及与正常胚胎相比，发育迟2d或2d以上的胚胎定为D级。

5 胚胎的保存

许多优秀供体的胚胎常经液氮冷冻保存多年。用于冷冻保存的胚胎是经质量鉴定的A、B级胚胎。现有的牛胚胎冷冻方法有五种

5.1 传统的冷冻法

具体步骤为①在室温下，胚胎放入小分子渗透性冷冻保护剂中，如：乙二醇、甘油、DMSO或丙二醇中直到胚胎冷冻保护液达到平衡；②在－5℃到－7℃诱发结晶（植冰）；③以0.2℃～2.0℃／min速度冷冻；④在－35℃到－75℃时浸入LN2并保存在LN2中；⑤以大约250℃／min（如25℃静止水浴）解冻；⑥在培养或转移前室温下脱冷冻剂。为确保冷冻胚胎存活率，严格按照冷冻程序进行冷冻是非常重要的。

5.2 一步细管冷冻保存法之一（甘油冷冻剂）

Loibo，SP（1984）发明了牛胚胎一步细管冷冻保存法，方法为：将冷冻液（1.5mol／L甘油）和解冻液（0.5～1.0mol／L蔗糖）放在同一细管内：两种液体用气柱分开，解冻时，轻轻摇动细管使两种液体混合，由于蔗糖是高渗溶液，使甘油从牛胚胎内脱出。这种方法不需要显微镜观察，直接把胚胎移入母畜体内，胚胎进入子宫后，通过吸收子宫水份而使其恢复到最初的等渗体积状态。实验结果发现，这种方法受体牛妊娠率不稳定。主要原因是：①在细管内冷冻液和解冻液难以混合；②胚胎易粘在细管棉塞上造成丢失；③当解冻温度升高时，高浓度蔗糖对胚胎发育有害。

5.3 一步细管法冷冻保存法之二

考虑到甘油冷冻剂分子量高和对细胞膜通透性差的特点，Hernandez－Ledezma，JJ（1988）等提出使用高渗透性、低毒性的冷冻保护剂如乙二醇或丙二醇对一步细管法冷冻保存牛胚胎进行了改进，该方法为直接用1.4M乙二醇进行牛胚胎冷冻，冷冻和解冻方法同传统方法。不同之处，是解冻后将胚胎连同冷冻保护剂一起直接移植到母畜体内，不需要摇动细管使冷冻和解冻液混合（未有解冻液）。这种方法具有不需要特定的仪器设备、操作简单等特点。实验结果表明，总的牛胚胎移植妊娠率接近传统的冷冻保存方法。该冷冻是牛胚胎移植产业化最理想的方法之一。

5.4 快速冷冻

顾名思义，该方法主要加快了冷冻速度，由传统冷冻法250℃／min提高到1 250℃／min，这样使冷冻时间由过去的3h缩短到30min（Rayos，1992；Shaw，1991），使用方法是利用2～4.5mol／L渗透性冷冻保存液如甘油、乙二醇，DOSO或乙二醇与0.25～0.5mol／L渗透性冷冻保存液如蔗糖、海藻糖、半乳糖或乳糖混合物作为哺乳动物胚胎冷冻保存液，平衡30s到3min后，处于部分脱水胚胎放入液氮蒸气中冷冻后浸入LN2中。在快速冷冻过程中，细胞外水份被冷冻，同时提高冷冻液的渗透压，促使细胞水份进一步渗出。利用此法冷冻胚胎，细胞内有可能形成冰晶。在解冻过程中如果解冻速度不当会造成胚胎损伤，牛胚胎快速冷冻后存活率为33.3%，低于传统的快速冷冻法和玻璃化冷冻方法（Niemann H，1986）［5］。

5.5 玻璃化冷冻法

是近年来发展起来的一种新的方法。将胚胎在适当的冷冻保护剂混合液中作短暂处理后，直接投入液氮。冷冻保护剂在急剧降温到很低温度时能被浓缩而不结晶，而且液体的粘性增强，由液态变为透明的固态，形成玻璃化。用这种方法冷冻，无需冻前分步添加抗冻剂和冻后分步脱除抗冻剂的繁琐步骤，简化了冷冻过程，是一种简便、快速、有效的冷冻方法，不需要冷冻仪器。

6 胚胎移植

6.1 受体牛的准备

要求受体牛发情时直肠检查的卵泡直径在10～20mm左右，发情后36h出现排卵。移植前检查黄体，其直径在11～15mm以上，黄体的手感性好，质地软而充实。

6.2 受体牛处理

用2%普鲁卡因2～5mL实施1～2尾椎间隙硬膜外腔麻醉，系尾，清洗外阴，用高锰酸钾水冲洗消毒，用灭菌纸擦干，最后用酒精棉球消毒。

6.3 胚胎选择

根据受体牛的发情天数选择不同胚龄的胚胎。一般将致密桑椹胚、早期囊胚和囊胚分别移植给发情6d、7d、8d的发情母牛。

6.4 移植

胚胎移植时可用0.25mL吸管分三段吸入PBS保存液，中间由两个气泡隔开，中段含有胚胎［6］。剪去封口端，轻轻甩向棉塞端，装枪，把移植枪推入黄体一侧的子宫角，并使其深入到子宫角的大弯部，持移植枪的右手推出胚胎，缓慢旋转地抽出移植枪。

7 受体牛妊娠

在移植后第12～15d观察受体牛发情返情情况。若牛出现返情，则表明移植失败；如未发情，继续观察3～5个情期，并在适宜时期进行妊娠诊断，通常用直肠检查法在移植3个月时检查。在妊娠90 d时，子宫继续增大，落入腹腔，可感觉胎儿的浮动，孕角出现孕脉，有时可触摸到子叶［7］。

8 技术应用存在的问题和应用前景

8.1 存在的问题

我国胚胎移植技术起步较晚，目前牛胚胎移植技术在推广在中还存在一些问题：①是专业技术人员缺乏，因为在操作过程中，大部分环节要靠操作者娴熟的操作技能把握分寸，确定最佳时机、最佳位置，以取得最佳效果；②是胚胎移植费用较高，限制了它的大量推广；③是纯种动物胚胎来源主要靠超排，由于无法完全掌握其规律，还不能预测超排结果，不同个体对超排处理的反应差异较大，排卵率不够稳定；④是胚胎回收率低，通常在50%～80%；⑤是移植成功率低，现世界范围内胚胎成功率多在50%～60%［8］。

8.2 应用前景

因为牛的经济价值高、单胎、繁殖周期长、常年发情，所以采取胚胎移植技术生产优质奶牛、肉牛，是一条多、快、好、省的路子，它既是科学技术的增长点，也是经济发展的增长点，具有广泛发展空间和持续发展前景。今后随着科学技术不断发展更新，牛胚胎移植将在品种改良、乳业发展和胚胎工程、基因工程、干细胞研究等方面发挥越来越大的作用。

［1］谭丽玲，等.1987－1990年奶牛胚胎分割研究［J］.国外畜牧学——草食家畜，1990，8（增刊）：44－46.

［2］董月涛，王文俊.家畜同期发情研究概述［J］.中国畜牧业，2012，21（4）：16.

［3］王 琛，袁 宝，任文陟，等.牛胚胎移植技术的发展概况、研究进展及前景［J］.商丘师范学院学报，2007，23（3）：103.

［4］梅冬林.奶牛胚胎移植相关研究［D］.硕士学位论文，2005，（10）：18.

［5］李树静.牛胚胎移植产业化及相关生物技术的研究［D］.博士学位论文.2002，（6）：19－21.

［6］王统华，张国宝，张国仓，等.牛胚胎移植技术操作规程［J］.青海畜牧兽医杂志，2002，32（6）：44.

［7］周立新.奶牛细管输精、性别控制及胚胎移植技术的推广应用［D］.硕士学位论文，2004，（12）：17.

［8］李 波，丁丽华.牛胚胎移植技术的应用推广［J］.山东畜牧兽医，2007，28（4）：17.