壳聚糖纳米粒制备研究进展及在靶向给药系统中的应用

谢黎崖 柯金珍 陈月 吴永良

（厦门大学附属第一医院，福建厦门361003）

在靶向纳米药物拮抗肿瘤生长优势越来越明显的今天，寻找合适的载体材料显得尤为重要。壳聚糖作为多聚糖胺类的主要代表，因其本身特有的性能和结构，被作为生物医学和纳米药物载体的主要候选材料之一[1-2]。

壳聚糖是甲壳素脱乙酰化的产物，是地球上仅次于纤维素的最为丰富的天然聚合物，其化学名称为聚-2-氨基-2-脱氧-β-葡萄糖，是由N-乙酰氨基葡萄糖以α-1，4糖苷键缩合而成。壳聚糖的分解产物无毒性，对身体健康无害。壳聚糖的弱碱性使其表面仅带有弱正电荷，不会对周围的组织产生强烈刺激作用。它还有止痛、止血、促进伤口愈合、抗菌、抗酸、抗溃疡、降血脂和降胆固醇等多种作用[3-4]。壳聚糖分子中的氨基与羟基可与黏液中的糖蛋白形成氢键从而产生吸附作用。且黏膜中糖蛋白带有负电荷，壳聚糖能与黏膜之间的电荷相互吸引，因此壳聚糖对生物黏膜具有很强的特异黏附作用[5]，这种作用可延长壳聚糖在体内特定区域的滞留时间。其具有良好的生物相容性，毒性也很低，是作为生物医学工程和制备药物载体的良好材料。近年来，壳聚糖纳米粒作为药物载体的研究已成为热点。本文就壳聚糖纳米粒的制备方法、在靶向给药系统中的应用进行综述。

1 壳聚糖纳米粒的制备方法

随着对壳聚糖物理化学和生物特性的不断揭示，壳聚糖纳米粒现已被公认为是一类极具应用前景的药物控释载体。这类载体的制备技术主要包括共价交联、离子交联、沉淀析出、自组装构建和大分子复合5种方法。

1.1 共价交联法

共价交联法是利用壳聚糖分子链上的氨基和羟基可以和一些化学交联剂反应的特点来制备壳聚糖类药物纳米载体。已报道的利用共价交联法制备壳聚糖纳米粒的文献很多，常用的交联剂有：戊二醛、甘油醛、甲醛、环氧氯丙烷等。Ohya Y等[6]是最早采用戊二醛交联剂利用壳聚糖上的氨基，接枝上活性药物氟尿嘧啶，制备得包含抗癌药物氟尿嘧啶的纳米粒。Kumbar SG等[7]采用该方法制备出了球形且表面光滑的壳聚糖微粒，粒径范围为40～230μm。在使用的各种交联剂中，戊二醛交联的微球拥有最低的药物释放速率。然而，需要指出的是共价交联往往会对细胞的存活率和大分子药物的活性产生不利影响，而且交联剂毒性较大，因而用该法制得的壳聚糖纳米粒在应用上有一定局限性。

1.2 离子交联法

离子交联法是目前在载药壳聚糖纳米粒的研究中使用最多的方法。1989年，Bodmeier R[8]首次提出了这种方法，它是利用无毒的三聚磷酸钠（TPP）对壳聚糖进行离子诱导凝胶化形成纳米粒。Zheng AP等[9]利用这一技术制备了纳米粒，通过对纳米粒的理化性质、体外释放进行表征，发现壳聚糖相对分子质量对粒子性能的影响有限，TPP的量和包裹的蛋白类型影响更大。Fernandez UR等[10]制备了一种负载胰岛素的壳聚糖微粒。将胰岛素和TPP混合，在高速搅拌下滴入壳聚糖醋酸溶液中，其中壳聚糖与TPP浓度之比为6∶1。制备出了粒径在300～400 nm，载药率达到55%的微粒。中国武汉大学Xu Y课题组[11]以牛血清蛋白为代表药物，用离子凝胶法得到了表面光滑的微球。研究发现分子量、壳聚糖脱乙酰度、壳聚糖和牛血清蛋白的浓度都会影响药物的释放速率和缓释效果。该方法操作简单，反应条件温和，不需使用有机溶剂，避免了交联剂可能造成的毒副作用。但是，离子交联法制备的粒子不稳定，易受到环境变化的影响而发生变形或者分解。

1.3 沉淀析出法

Berthold A等[12]首先提出使用硫酸钠为沉淀剂制备壳聚糖微粒。过程中将硫酸钠加到壳聚糖和吐温-80的溶液中，在搅拌与超声波分散的条件下，壳聚糖微粒形成并析出。所得的微粒介于微球和纳米粒之间。该方法经Tian XX等[13]改进，用于表面吸附有抗肿瘤药物如牛血清白蛋白、细菌蛋白多糖等的壳聚糖纳米载体的制备，获得粒子的粒径范围为600～800 nm。沉淀析出法的另一制备途径是应用乳化剂的扩散作用。实验时，将溶有药物的壳聚糖溶液借助乳化剂的作用分散在亲水性有机溶剂和疏水性有机溶剂混合的油相中，利用亲水性有机溶剂会自动向水相扩散而产生两相界面流动，从而使壳聚糖分子发生沉降析出，形成想要的纳米尺度的微粒[14]。可是，沉淀析出法需在较苛刻的制备条件如存在乳化剂、有机溶剂和超声振荡下进行，且不易通过反应条件的优化调控壳聚糖微粒的大小，因而这种方法在实际应用上亦受到一定程度的限制。

1.4 自组装构建法

这种方法是通过对壳聚糖分子进行修饰，引入疏水基团，使其成为两亲性物质，在溶液中自发形成纳米结构。Ohya Y等[15]通过在壳聚糖分子链上接枝上聚乙二醇，发现在碱性条件下，壳聚糖骨架链表现出疏水性质，而聚乙二醇链则表现的是亲水性，这种改性壳聚糖在水溶液中可以发生胶束化，从而自组装形成核壳型纳米粒子。这种制备方法条件温和，而且粒子表面存在大量的亲水性基团或离子基团，因此一类亲水性强的大分子药物，如牛血清白蛋白、多肽、胰岛素等便容易通过静电或者氢键相互作用结合在粒子表面。Sun W等[16]利用改性壳聚糖自组装形成纳米粒载依诺肝素，考察了纳米粒形成的影响因素。通过研究发现，体系pH、壳聚糖与依诺肝素的质量比、壳聚糖的浓度、分子量和结构均对纳米粒的形成有影响，可以通过使用不同的壳聚糖衍生物来调节纳米粒的粒径、电荷和外观形状等理化性质。刘占军等[17]通过在壳聚糖上接枝醋酸乙烯酯，在水溶液中制备了具疏水核心和亲水表面的纳米粒，再通过混合紫杉醇制备载药纳米粒子。壳聚糖纳米粒和载药纳米粒的粒径分别为196 nm和320 nm，粒子表面均带有正电荷。由于这类方法的许多优点，有关这方面的研究越来越引起人们的重视。

1.5 大分子复合法

通过壳聚糖阳离子与另外一种负电荷的大分子药物，利用两种聚离子的相互作用从而使壳聚糖的溶解度降低而凝聚，在一定条件下形成纳米微粒。周旭等[18]通过该方法制备了抗毒酶基因纳米粒，通过正交设计法，得出了最佳反应条件，所制备的纳米粒子粒径在100 nm以下，平均Zeta电位是（15.9±6.3）mV。刘振华等[19]采用大分子复合法制备了载基因纳米粒子，并且对它的体外相关性质进行了初步研究，其结果显示：纳米粒子形态规则，大多呈球形，粒径小，分布窄，包封率大于90%，载药量也达到了30%。利用大分子复合原理，近年来有不少研究者将壳聚糖同生物活性大分子DNA进行反应复合形成纳米粒，进而将其作为基因或者蛋白药物的载体。

2 壳聚糖纳米粒在靶向给药系统中的应用

2.1 组织靶向给药

靶向给药系统是指借助载体、配体或抗体将药物通过局部给药胃肠道或全身血液循环而选择性地浓集定位于靶器官、靶组织、靶细胞或细胞内结构的给药系统。实现组织靶向能够带来较高的瘤内浓度，提高分子和受体的特异性配体间受体，从而达到主动靶向。壳聚糖纳米粒制成的靶向制剂可以到达不同的靶向部位而提高药物治疗作用。

Son YJ等[20]用物理捕获法将阿霉素装进乙二醇-壳聚糖纳米粒，将其注射到荷瘤鼠尾部静脉中，发现其主要分布在肾、肿瘤及肝脏中，其含量在8 d内均保持在一个较高水平，在肿瘤组织中分布逐渐增多，抑制肿瘤生长超过10 d。汤爱国等[21]制备了O-羧甲基乳糖酰化壳聚糖-聚乳酸阿霉素纳米粒。动物实验中静脉注射同等剂量不同剂型的阿霉素药物，用荧光光度计测量。结果半乳糖化修饰后纳米粒的肝靶向性明显增强，肝外器官的浓度明显降低。证明了O-羧甲基乳糖酰化壳聚糖-聚乳酸阿霉素纳米粒对正常大鼠肝脏具有明显的靶向性。Hou ZQ等[22]利用叶酸和聚乙二醇进行功能化修饰，制备壳聚糖丝裂霉素纳米粒，通过噻唑蓝比色试验、激光共聚焦和对荷H22小鼠的肝实体瘤抑制率试验，发现该纳米粒始终大部分在肝部富集，也表明了其具有组织靶向、长循环以及治疗肿瘤的特性。

2.2 细胞内靶向给药

一般说来，肿瘤细胞具有比正常细胞表面更多的负电荷。壳聚糖纳米粒所带的正电荷对肿瘤细胞表面具有选择性吸附和电中和作用，且壳聚糖还具有直接抑制肿瘤细胞的作用，并通过活化免疫系统促进人体抗肿瘤作用，从而与抗肿瘤药发挥协同作用。

You J等[23]设计合成了硬脂酸壳聚糖，其在水中能自组装形成具有类似糖结构的、含多个疏水区域的胶束。细胞毒性实验证明，紫杉醇胶束制剂的细胞毒性高于游离紫杉醇，原因是胶束介导的跨膜转运极大地增加了药物在细胞内的浓度。荧光图像也提示细胞对胶束有良好的内摄作用，包埋于胶束的紫杉醇可以被转运入细胞并定位于细胞质。Veiseh O等[24]制备了涂有生物相容性的聚乙烯乙二醇-Fe3O4壳聚糖纳米粒，建立了脑部肿瘤的大鼠模型，通过体内核磁共振成像以及组织学和生物学的分析，证明了合成物是无毒性的，而且能够轮廓清晰地持续保留在肿瘤上。说明涂有生物相容性的聚乙烯乙二醇-Fe3O4壳聚糖纳米粒可以被潜在地用于诊断和治疗多种肿瘤类型。Sahu SK等[25]研制的载多柔比星的叶酸-羟甲基壳聚糖纳米粒与HeLa细胞株特异性结合，并发现载药纳米主要分布在细胞浆内，考虑此现象与叶酸受体介导的内吞作用相关。徐强[26]采用复合乳液溶剂挥发和界面交联技术制备了叶酸偶联壳聚糖载羟基喜树碱纳米药物制剂，在体外模拟释放介质中表现出明显的先快速后缓慢释药的现象。这种现象可使药物进入体内后，首先快速杀死血液中残留的肿瘤细胞，然后与肿瘤组织细胞表面受体结合，经内吞进入细胞，发挥缓释效能。

2.3 基因靶向传递

基因治疗在替代功能障碍基因和肿瘤治疗方面具有良好的应用前景。在基因治疗过程中最重要的是选择合适的基因靶向传递系统。非病毒载体主要有裸DNA、脂质体、阳离子多聚物等，壳聚糖纳米粒子属于阳离子多聚物，它作为非病毒基因转运载体越来越受到更多学者的关注[27]。为了提高壳聚糖载基因纳米粒在体内的转染效率，常通过提高纳米粒对靶细胞的特异识别和结合、提高纳米粒的穿膜作用及通过各样修饰促进在细胞质中的扩散、抵抗核酸酶的降解作用和促进进入细胞核的作用，达到提高纳米粒在细胞内的转运和载基因表达的效果[28]。

Bhattarai SR等[29]制备出N-乙酞壳聚糖-金纳米粒（Nac-6-Au），它可与DNA结合作为基因传递载体。体内和体外实验都证实了Nac-6-Au纳米粒作为基因传递载体对细胞具有较高的转染率，且转染率的高低与细胞种类有关。该载体对于MCF-7乳腺癌细胞的转染率很高，这种特性可能会应用于乳腺癌基因治疗中靶向定位基因传递。Zheng Y等[30]在用叶酸修饰的N-三甲基壳聚糖（folate-TMC）作为基因载体的研究中也得出，基因转染效率随着氮磷比（N/P）的增大而提高，folate-TMC/pDNA复合物在叶酸受体过量表达的细胞系上的基因转染效率是TMC/pDNA复合物的1.6倍。Morris VB等[31]对组氨酸修饰的三甲基壳聚糖（HTMC）进行聚乙二醇和叶酸（PEG-FA）衍生化，然后通过介导荧光素酶的表达来考察聚乙二醇和叶酸修饰的三甲基壳聚糖（HTMCPEG-FOL）衍生物（HTFP）在KB细胞上的基因转染效率。结果显示，PEG-FA衍生化的HTMC的转染效率明显高于聚合物本身。

3 结语

壳聚糖纳米粒作为一种新型的药物载体，其在缓控释和靶向等药剂学的前沿领域中取得了巨大的进展。根据壳聚糖的结构特点和药物本身性质，载药壳聚糖纳米粒可以通过多种方法制备获得。壳聚糖纳米粒特别适合于抗肿瘤药物、基因、蛋白质、多肽等生物活性大分子药物的包载，已成为靶向和缓控释研究的热点，具有广阔的应用前景。随着科研的不断发展进步，壳聚糖纳米粒将踏入更加广泛的药物治疗领域，在众多化学合成药和天然药物中取得更大的突破。

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