肺腺癌驱动基因研究相关进展

王敬慧 综述 张宗德 张树才 审校

全球范围内，肺癌居癌症死亡原因的首位。肺癌包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC），NSCLC占80%，分为不同的组织学类型，包括腺癌、鳞癌、大细胞癌、腺鳞癌、肉瘤样癌等，其中腺癌占50%以上。肺癌患者远期生存率低，5年生存率仅为10%-15%，当今急需更有效的治疗策略。

“Oncogene addiction”是指肿瘤细胞的发生、生存和增殖依赖于活化的癌基因的现象，这些异常的分子信号也称为驱动癌基因（driver oncogenes）。癌细胞需要驱动癌基因持续发挥功能，而正常细胞则不需要，因此，癌基因可作为明确的治疗靶点，使靶向药物特异性地杀伤肿瘤细胞，而不损伤正常细胞。过去的十几年里，许多研究在发现驱动基因方面取得了明显进步，以驱动基因为靶点的药物治疗也获得了较为明显的疗效，多项研究[1,2]证实表皮生长因子受体酪氨酸激酶活性抑制剂（epidermal grow th factor receptor tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI）治疗EGFR基因突变患者的疗效明显优于传统的化疗和野生型患者。2007年，日本学者在NSCLC中发现的棘皮动物微管相关蛋白样4-间变淋巴瘤激酶融合基因（echinodern m icrotubule-associated protein-like 4 anaplastic lymphoma kinase, EML4-ALK）是一个新的驱动基因，以其为靶点的药物克唑替尼（crizotinib）在ALK阳性的晚期NSCLC患者中获得了很好的疗效。本文将对肺腺癌驱动基因的研究进展作一综述。

1 肺腺癌各驱动基因的意义

1.1 EGFR EGFR是一个170 kDa的酪氨酸跨膜受体，跨膜酪氨酸激酶ErbB家族4个成员之一，也称为HER1或ErbB1，该家族还包括HER2、HER3和HER4。同源配体与胞外受体结合，导致两个EGFR同型二聚体或异型二聚体结合，致EGFR胞内部分自动磷酸化，激活酪氨酸激酶。随后，细胞内的多个通路包括RAS/RAF/MEK/MAPK、PI3K/AKT/mTOR相继激活，共同促进癌细胞增殖、生长、侵袭、转移及肿瘤血管生成。2004年有研究首次报告EGFR受体酪氨酸激酶区域突变。NSCLC中EGFR最常见的突变有两个，一个是外显子19缺失（LREA缺失，delE746-A750），占45%；另一个是外显子21上的突变，即858密码子亮氨酸替代精氨酸（L858R），占40%。约10%高加索人和近50%亚裔患者存在EGFR敏感突变[3]，在肺腺癌、不吸烟、女性、亚裔中频率更高[4]。T790M（苏氨酸-790-蛋氨酸）突变与TKI治疗的耐药有关，研究[5]发现50%疾病进展患者有此种突变 ，它可能是继发性突变，也可能是治疗前在小的克隆中已经存在的突变（此种约占5%）。另外还存在几种少见的敏感突变和耐药突变，敏感突变有外显子18的G719C、G719S、G719A突变（5%），外显子20的V756A、T783A突变（＜1%），耐药突变有外显子19 D761Y突变（＜1%）[6]。2012年NCCN指南推荐EGFR-TKI用于有EGFR敏感突变的非鳞NSCLC患者的一线治疗，无突变或突变状况不明的非鳞患者的维持治疗，非选择的PS评分为0分-2分的非鳞患者的二线及三线治疗及有EGFR敏感突变的PS评分为3分-4分患者的二线和三线治疗。

荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization,FISH）方法发现30%-60%的晚期NSCLC的EGFR基因拷贝数增加，免疫组化方法发现晚期NSCLC中EGFR蛋白表达50%-90%，目前EGFR拷贝数及蛋白表达的预测TKI疗效的作用还存在争议，EGFR基因突变仍是最强的预测疗效的因素[7]。

EGFR通路主要包括两个下游信号通路：RAS/RAF/MEK和PI3K/AKT/mTOR。

1.2 RAS/RAF/MEK通路

1.2.1 KRAS（kirsten-rous avian sarcoma） RAS家族蛋白有3个编码基因：HRAS、KRAS和NRAS，这3种基因在人类肿瘤上均很常见。研究[8,9]显示，北美腺癌患者中KRAS突变频率约为25%，亚裔患者KRAS突变率约5%。腺癌突变率明显高于其它组织类型，在吸烟患者多见[10]。KRAS突变位点为密码子12、13和61，90%突变发生在外显子2的12密码子[11]。多项研究证实，KRAS突变是肺癌患者独立的预后因素，突变患者的预后较KRAS野生型差[12]，突变者对TKI耐药，但并不影响化疗的疗效[8]。目前尚无针对KRAS的靶向治疗药物，靶向药物联合化疗或联合抑制PI3K和MEK的靶向药物治疗KRAS突变患者正处于临床研究中。

1.2.2 BRAF BRAF是KRAS下游的丝氨酸/苏氨酸激酶，将RAS鸟苷三磷酸连接到丝裂原活化蛋白激酶家族的下游蛋白，控制细胞增殖。RAF激酶家族包括3个成员：A-RAF、B-RAF和RAF-1（也称为C-RAF）[13]。体细胞BRAF突变最初是在黑色素瘤中被发现，约80%的突变影响激酶结构域中外显子15的Val600残基。NSCLC中BRAF突变占1%-3%，绝大多数是在腺癌[14]。Paik等[15]检测697例肺腺癌患者BRAF的突变率为3%，有突变的患者都是吸烟或既往吸烟者，V600E是最常见的突变，占50%，位于外显子15，其它突变类型有G469A（39%）、D594G（11%），分别位于外显子11和外显子15。BRAF突变与酶活性增加相关，导致MAPK2和MAPK3组成型活化。现已研发出多个BRAF抑制剂（PLX4032、XL281、selumetanib、GSK2118436），其中最有前景的复合物是PLX4032（vemurafenib），它是选择性BRAF小分子抑制剂，对BRAF V600E突变阳性的黑色素瘤有非常明显的疗效[16]，其对肺癌的疗效还有待评价。

1.2.3 丝裂原活化蛋白激酶（motigen-activated protein kinase, MAP2K1） 也称为MEK1，是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，位于BRAF的下游，活化B-RAF下游的MAPK2、MAPK3。现已明确肿瘤中MAP2K1有3种突变：Q56P、L57N和D67N，所有突变均发生在蛋白的非激酶部分。NSCLC中MAP2K1突变率为1%，主要是在腺癌。

1.2.4 PTEN（phosphatase and tensin homologue） PTEN是抑癌基因，通过将PIP3去磷酸化抑制AKT活化来拮抗PI3K/AKT信号通路。PTEN缺失突变或未活化导致PIK-3CA基因自身功能增强，PI3K/AKT发生组成型活化，激活RAS癌基因。PTEN缺失在鳞癌中多于腺癌。此外，PTEN缺失伴随磷酸化AKT过表达，与预后差相关[17]。近来研究[18]证实PTEN可保护基因组的稳定性。也有研究[19]报告PTEN与TKI耐药有关。现有临床试验评估PI3K抑制剂在PTEN缺失肿瘤中的疗效。

1.3 PI3K/AKT/mTOR通路

1.3.1 PIK3CA 是脂类激酶，再合成磷脂酰肌醇-3-磷酸盐，后者是生长受体和细胞内下游信号通路的关键介质。PI3K以异二聚体形式存在，包括1个催化亚单位和1个调节亚单位，是细胞增殖和凋亡的重要调节因子。PI3K由三类复杂的家族成员组成，每一类有多个亚单位和亚型，PI3Kα是这个家族中研究最多的一种酶。PIK-3CA编码I类PI3K的p110α催化亚单位。30%恶性胶质瘤、胃癌中可见PIK3CA突变，但在肺癌中极少约2%[20]。30%鳞癌和6%腺癌中可见到基因扩增[21]。PIK3CA最常见的两个突变区域是外显子9和20，分别编码蛋白螺旋和激酶结构域。这些突变导致液态激酶活性增强及PI3K/AKT信号通路的组成型活化。NSCLC中PIK3CA突变最常影响外显子9的编码催化结构域的E542和E545残基，这些突变在鳞癌中较腺癌多见，常发生在EGFR突变的肿瘤[22]。体外实验显示PIK3CA突变的肿瘤对EGFR耐药。小分子抑制剂BEZ235以PI3K、mTOR蛋白为靶点，在小鼠中已显示出抗肿瘤活性。多个PI3K抑制剂已进入早期临床试验，疗效有待进一步被验证。

1.3.2 AKT 又名蛋白激酶B，是PI3K下游的丝氨酸/苏氨酸激酶，被PI3Kα激活，调节PI3K信号通路。AKT1基因中一种主要的频发突变为E17K，已在乳腺癌、结肠癌、卵巢癌等几种实体瘤中被鉴定[23]，NSCLC中突变率为1%[24]，仅在鳞癌中被鉴定，与抗凋亡有关。对EGFR-TKI有效的病例中可见AKT磷酸化增强，AKT可能被EGFR突变活化。蛋白激酶B抑制剂MK2206已进入I期临床试验。1.3.3 mTOR 是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，作为雷帕霉素的细胞内靶点被鉴定。mTOR通过AKT磷酸化而激活，促进细胞增殖。mTOR的上游调节因子是PI3K/Akt通路，激活mTOR对生长因子发生反应，通过真核启动因子4E结合蛋白1和40S核糖体蛋白S6激酶两种不同通路参与对翻译的调节[25]，在EGFR信号传导通路中起抗凋亡的作用。现已研发出几种抑制剂，并取得了一定的疗效。

1.4 人类表皮生长因子受体2（human epidermal grow th factor receptor 2, HER2） HER2突变在NSCLC中约为2%，为外显子20插入突变，最常见于776密码子Tyr-Val-Met-Aal序列，与HER2激酶组成型活化有关，导致下游效应器如AKT、MEK磷酸化。HER2突变在不吸烟、女性、亚裔患者中多见，腺癌明显多于其它NSCLC[26]。HER2突变与EGFR或KRAS突变互斥。曲妥珠单抗在治疗HER2阳性乳腺癌取得了非常明显的疗效，但早期临床试验中它对非选择NSCLC中仅表现出微乎其微的作用。基础研究[27]显示，携带突变基因的细胞对作用于EGFR和HER2的药物，如拉帕替尼，一种小分子酪氨酸激酶抑制剂治疗敏感，但对只作用于EGFR的抑制剂不敏感。表达HER2突变的转基因鼠发生肺腺癌，在BIBW 2992（作用于EGFR和HER2的抑制剂）与雷帕霉素（mTOR抑制剂）联合作用下，肿瘤明显缩小。与此类似，另一项试验[28]中HER2突变阳性的肺腺癌患者接受BIBW 2992治疗也获得了较好的疗效。

1.5 LKB1 LKB1以前也称之为丝/苏氨酸蛋白激酶11（serine theronine protein kinase 11, STK11）。1997年LKB1基因突变首次被报告，位于染色体19p13.3，可引起peutz-jeghers综合征（黑色素斑-胃肠多发性息肉综合征）[29]。患有此综合征患者易患各器官的多种肿瘤，其中胃肠道肿瘤最常见。LKB1突变在NSCLC中多见，20%-30% NSCLC有LKB1突变，腺癌中突变率最高（白种人约30%、韩国人8%、日本人7%）[30]。LKB1基因被认为是一个抑癌基因，与p53和CDC42相互作用，调节AMP活化蛋白激酶的活性。LKB1其它抑制肿瘤的特性可能包括抑制mTOR介导、调节细胞极性和抑制细胞周期及p53活性。2008年Koivunen等[31]对310例NSCLC肿瘤标本的检测发现LKB1突变多见于腺癌（13%），明显多于鳞癌（5%），LKB1突变与吸烟、KRAS突变相关，与EGFR互斥。

1.6 MET（mesenchymal-epithelial transition factor） MET编码肝细胞生长因子受体（hepatocyte grow th factor receptor, HGFR），是一种酪氨酸激酶膜受体，位于染色体7q21-q31。MET受体或肝细胞生长因子（hepatocyte growth fator, HGF）及它的配体HGF可触发胞内关键的信号级联，如RAS/RAF/MEK、PI3K/AKT/mTOR、Rho、Rac1、CDC42等[32]。通过HGF或MET过表达、MET基因扩增、突变，发生HGF/MET调节异常，导致细胞增殖、侵袭、迁移及血管生成。与肾癌和胃癌不同，MET激酶结构域突变在NSCLC较为罕见。Ding等的研究[33]发现，188例肺腺癌中，仅确定3例有MET突变，2个发生在编码近膜域的外显子13上，1个在编码激酶结构域的外显子18上，这些突变的意义目前尚是未知的。队列研究发现既往未接受过EGFR-TKI治疗的NSCLC患者中MET扩增约为1.4%-21.0%，数据范围较大的原因与不同研究采用的方法和截断值有关。MET扩增可见于鳞癌和腺癌。MET扩增与EGFR-TKI继发耐药有关[34]，有报道约20%TKI获得性耐药患者肿瘤中有MET基因扩增，驱动HER3依赖的PI3K活化。研究[35]报告HGF可能促进MET基因的扩增，与新的TKI耐药机制有关。现已有开发的HGFR小分子抑制剂。

1.7 EML4-ALK融合基因 2007年日本学者首先报告在NSCLC患者中发现EML4-ALK融合基因[36]。ALK基因编码的酪氨酸受体是一跨膜蛋白，胰岛素受体酪氨酸激酶家族的成员，其生理功能尚不清楚。正常情况下仅在中枢神经系统、小肠、睾丸等组织中有表达，正常肺组织不表达。EML4也位于2号染色体，其易位形成EML4-ALK融合基因，导致酪氨酸激酶结构域组成型二聚体化及非配体依赖性活化，激活下游的MAPK1和PIK3CA/AKT1信号通路，致细胞增殖、侵袭、凋亡抑制，ALK通路的下游效应器包括RAS活化蛋白、MAPK1、PIK3CA和STAT3信号通路[37]。研究发现EML4的外显子1-13与ALK的外显子20-29相融合。迄今已发现了15种EML4-ALK不同的基因变异体，这些变异体均有功能，最多见的是变异体1和变异体3a，分别在33%和29%患者中检测到[38]。

在非选择NSCLC患者中，EML4-ALK易位的频率在3%-7%，人种间无明显差异。几项研究显示，临床特征中年龄与ALK重排相关性最强，携带ALK重排患者的中位年龄明显低于阴性患者，但不同性别间ALK频率无差异，吸烟是否与其相关也不一致。EML4-ALK融合基因的频率在肺腺癌中多见，腺泡、筛子形、印戒细胞等组织学类型中多见[39]。EML4-ALK常在EGFR和KRAS野生型患者中表达，与EGFR、KRAS互斥。Shaw等[40]在141例NSCLC队列中，采用FISH方法发现不吸烟/轻度吸烟/EGFR阴性患者中ALK阳性率达33%。台湾Wu等[41]发表的研究中通过对有胸腔积液的肺腺癌患者的胸水检测EGFR突变，EGFR基因野生型患者通过RT-PCR检测ALK的阳性率为34%。多项研究报告的阳性率相差较多，与研究样本量的大小、样本是否经过筛选、检测方法等因素有关。EML4-ALK融合基因的检测有3种方法，即FISH、IHC和逆转录-聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR），NCCN推荐FISH用于检测ALK，其敏感性和特异性均较好，是I期、II期、III期克唑替尼临床试验中采用的检测方法，是目前检查融合基因的金标准。免疫组化的敏感性低，尚需进一步的标准化，RTPCR虽然敏感性高，但需在新鲜组织中检测。

克唑替尼是ALK和MET抑制剂。I期试验中82例（71%为复治）ALK阳性NSCLC患者接受克唑替尼，有效率为61%，疾病控制率88%，中位PFS为10个月，中位生存期还未达到[42]，克唑替尼在很短时间内被美国FDA批准上市，用于ALK阳性的晚期NSCLC治疗。II期研究（PROFILE 1005）中，ALK阳性NSCLC患者接受克唑替尼治疗，有效率为50%。III期研究（PROFILE 1014, PROFILE 1007）正在进行中。

1.8 Eph（erythropoietin producing human hepatocellula carcinoma cell line） 基础研究显示Eph是受体酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase, RTKs）家族最大的一个亚群，有促进肿瘤生长、侵袭、转移和肿瘤新生血管形成的作用。Eph受体包括15个受体和9个配体，分为两类，即A类和B类。A类中的EphA2和EphA3与肺癌关系较为密切。NSCLC肿瘤EphA2高表达与吸烟史、转移相关，尤其是脑转移，高表达患者预后差，EphA2被视为一个独立的肺癌预后标志。肺癌细胞中EphA3突变最常见，可能与肿瘤的驱动有关。肺癌患者中也发现B类Eph，EphB3过表达与NSCLC肿瘤大小、分化、转移有关。现已开发出以Eph为靶点的抗肿瘤药物[43]。

2 几项驱动基因筛查研究

Ding等[33]于2008年发表了第一个大样本的肿瘤基因筛查研究，在188例原发肺腺癌中筛查了623个候选基因，该研究除了筛查出肺腺癌已知的频率较高的几种突变，包括抑癌基因TP53、CDKN2A、STK11，癌基因KRAS、EGFR，以及几种频率较低的基因PTEN、NRAS、ERBB2、BRAF、PIK3CA，此外，还发现几种新的突变基因：抑癌基因NF1、RB1、ATM、APC，原癌基因ERBB4、KDR、FGFR4和NTRK。这项研究还对不同吸烟状况、肿瘤分化程度、肿瘤分期、组织学亚型等临床特征下突变的分布做了分析。

Kris等[44]在2011年ASCO上发表了来自LCMC（NCI's Lung Cancer Mutation Consortium）的一项研究，对1,000例肺腺癌标本中10种驱动基因进行检测。全部患者为IIIb期/IV期，PS评分为 0分-2分，有足够的组织标本。研究共入组830例患者，60%患者有驱动基因突变。各基因频率分别为：KRAS 25%、EGFR 23%，ALK重排6%、BRAF 3%、PIK3CA 3%、MET扩增2%、HER2 1%、MEK1 0.4%、NRAS 0.2%、AKT1 0，约36.4%肺腺癌不携带已知突变。95%的基因突变是互斥的。目前采用多重分析检测肺癌全部突变已成为半数LCMC机构病理科的常规。

美国马萨诸塞州总医院癌症中心的Sequist等[45]于2011年发表了1篇论文，采用多重PCR及SNaPshot测序对552例NSCLC患者福尔马林固定石蜡包埋的组织标本进行了多基因的检测，另外采用FISH检测ALK融合基因。全部患者中51%有驱动突变，常见的为KRAS、EGFR、ALK。各基因的频率分别为：KRAS 24%、EGFR 13%、ALK 5%、PIK3CA 4%。PIK3CA在鳞癌中多见，KRAS突变患者较野生型患者生存差（16.4个月 vs 22.5个月），EGFR突变患者生存优于野生型（34.3个月 vs 20.0个月）。研究显示全面的基因分型更有效地符合NSCLC的临床实践，在影响治疗决策和指导患者参与相关临床试验上有很大的实用性。

我国Xu等[46]采用SurPlex®-xTAG70plex平台对随机选择的861例中国NSCLC患者进行EGFR、KRAS、BRAF、PIK3CA 4个基因的检测，4个基因的频率分别为41.0%、8.0%、0.7%和3.7%。EGFR外显子19、20、21突变在女性中高于男性、腺癌高于其它病理类型、不吸烟者高于吸烟者。KRAS突变在男性中多于女性，腺癌多于其它类型，吸烟者多于不吸烟者；PIK3CA在腺癌中低于其它肺癌类型；全部患者中仅1例患者同时携带EGFR和KRAS突变。

2012年ASCO上，Yang等[47]在2012年ASCO上报告了PIONEER研究结果，即亚洲晚期肺腺癌EGFR突变的分子流行病学调查。研究采用Scorpion ARMS（TheraScreen® EGFR29 M utation Test Kit）对新确诊的IIIb期/IV期肺腺癌组织标本进行EGFR突变检测。共入组来自7个国家和地区的1,482例患者，肺腺癌EGFR基因的总突变率为51.4%，各国或地区的EGFR突变率分别为：越南64.2%（77/120）、台湾62.1%（108/174）、泰国53.8% （63/117）、菲律宾52.3% （34/65）、中国50.2%（372/741）、香港47.2% （76/161）、印度22.2%（16/72）；女性突变率61.1%，男性44.0%；不吸烟者突变率为60.7%，重度吸烟31.4%。人种（P=0.001）和吸烟包/年（P=0.001）是影响突变最重要的因素，吸烟状况调整后的不同年龄间突变率无差异。

上述几项研究中各队列的驱动基因的频率并不相同，这与队列的选择直接相关，采用的检测方法不同也会对结果有轻微的影响，不同的人种间的有些基因频率相差较大，如EGFR、KRAS在东西方患者差异较大，同一人种的基因频率也可能因性别、吸烟状况、年龄等而有不同。

3 展望

目前的靶向治疗虽得到一定的疗效，但总体上疗效并不是非常理想，因为肿瘤的形成是一个多基因参与的异常复杂的过程，现有的靶向药物如小分子激酶抑制剂多是针对一个靶点而设计，现也仅发现约50%肺腺癌患者携带不同的驱动基因，还有相当多的驱动基因未被发现，因此只有发现更多的驱动基因，阐明基因之间的相互作用关系，开发出更多的靶向药物，进一步明晰药物的代谢作用，联合应用或联合其它的治疗方式，才有可能收到理想的疗效。而且，大多数患者接受靶向药物治疗后会出现耐药问题，耐药机制尚未十分明确，耐药后的治疗方案也不十分理想。单一或少数几个基因检测已不能满足分子靶向治疗的要求，因此开发敏感性和特异性均较好的、高通量的能够同时检测融合、点突变、插入、缺失和扩增等多种基因异常的新平台，将更能适应临床治疗策略的需要。此外，临床上许多患者是通过细胞学或微小的活检诊断，标本不能满足多基因的检测，因此，在临床实践中需加强多学科间合作，不断提高肿瘤科、胸外科和呼吸科医生等对组织学标本重要性的认识。总之，真正实现肺癌的个体化治疗仍然任重而道远。