TDP－43蛋白与运动神经元病

张巍 孟令超 袁云

运动神经元病（motor neuron disease，MND）又称肌萎缩侧索硬化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS），是以上、下运动神经元受累为主要病理改变的进行性、致死性神经系统变性病［1］，主要临床表现为进行性加重的肌无力和肌萎缩，部分患者伴随痴呆。此病缺乏有效的治疗措施，患者病程后期往往因出现吞咽困难和呼吸肌无力而死亡。MND发病率约为（1.5～2.5）／10万，多数患者为散发型（sporadic MND，sMND），5%～10%为家族型 （familial MND，fMND）。其特征性的病理改变是进行性上、下运动神经元变性，表现为运动神经元脱失伴随反应性胶质细胞增生，残存下运动神经元胞质内发现Bunina小体，在大脑运动皮质下行的锥体束出现变性改变。1991年Leigh等在MND患者的脑和脊髓运动神经元胞质内发现泛素化团样或圆状包涵体，成为MND的特征性病理改变，这些改变也出现在中枢神经系统非运动区，包括额颞叶皮质、新纹状体、黑质神经细胞以及营养不良的轴索等，被认为与MND患者痴呆、锥体外系病变等一系列临床表现相关，从而改变了MND为单一运动系统受累的传统观点。2006年研究者们明确了TAR DNA结合蛋白43（transactivation response DNA－binding protein 43，TDP－43）是MND患者脑和脊髓中泛素阳性、Tau蛋白和突触核蛋白阴性包涵体的主要成分［2－3］，而以MND为代表的病理性TDP－43蛋白沉积为主的一系列疾病被统称为TDP－43蛋白病（TDP－43 proteinopathies）［4］，后者与 Tau蛋白病（Tauopa－thies）、突触核蛋白病（a－synucleinopathies）并列成为以蛋白沉积为基础的神经变性病的新分类。基于近年来TDP－43蛋白在MND研究中逐渐显露的重要性，该文就TDP－43蛋白在MND中的病理表现形式、沉积部位、影响因素及其在MND发病中的机制和意义做一综述。

1 TDP－43蛋白

TDP－43蛋白由定位于Chr1p36.2的TARDBP基因编码，是具有414个氨基酸，相对分子量为43000的蛋白质，它包含2个RNA识别区和一个富含甘氨酸的末端，使其可以结合单链DNA、RNA和蛋白质。除具有转录和剪切调控的功能外，TDP－43蛋白也参与了microRNA处理、细胞分裂和信使RNA的稳定等。TARDBP基因敲除的小鼠于胚胎早期即死亡，表明TDP－43蛋白对胚胎早期发育具有重要作用［4－5］。生理性 TDP－43蛋白主要分布在细胞核，少量出现在核周胞质。由于TDP－43蛋白具有广泛的生理功能，其表达受到核定位信号和转移信号等的调控并易于受到机体生理状态的影响，在疾病和应激状态下，TDP－43蛋白可表现为核内包涵体、胞质聚集体、核周深染、胞质弥漫着色等一系列病理形态学改变，病理性TDP－43蛋白可由TARDBP基因突变以及磷酸化、泛素化和N末端截短等修饰过程所导致，与生理性结构比较，其状态不稳定而更易聚集［2，6］。

2 TDP－43蛋白在MND中的表达

在散发型和非超氧化物歧化酶1（superoxide dimutase 1，SOD1）突变的fMND中，TDP－43均为主要和特征性的病理沉积蛋白［1－2］，类似的蛋白沉积模式也出现在单纯额颞叶变性（frontotemporal lobar degeneration，FTLD）和伴随额颞叶变性的MND（FTLD－MND）中，提示 TDP－43蛋白沉积可致不同 临床 表 型［2－3，7－8］。Mackenzie等 研 究 111 例MND患者发现，在所有sMND、伴随痴呆的MND和无SOD1突变的fMND患者的神经元和胶质细胞胞质内出现了TDP－43阳性包涵体，伴核内TDP－43蛋白减少［7］。脊髓 TDP－43阳性包涵体主要出现在前角运动神经细胞，在脑干出现在红核、面神经核、舌下神经核、疑核、下橄榄核及网状结构的神经元胞质内，而在大脑主要出现在丘脑和运动皮层神经细胞内，其他区域包括脊髓背根神经节、脊髓后角、小脑齿状核、外展神经核和动眼神经核相对少见。包涵体也可出现在胶质细胞，主要在少突胶质细胞，偶见于星形细胞突起中，另有少量出现在细胞核内和营养不良的轴索。神经元内TDP－43阳性包涵体形态各异，在胞质中呈线丝样、圆状、致密小体样或颗粒样外观。超微结构下这些包涵体为颗粒细丝结构，但并不具有类淀粉细丝的特点，其刚果红染色为阴性［1］。此外，TDP－43蛋白也在MND患者的脑脊液、血液甚至皮肤组织中出现异常表达［9－10］。而在患者肌肉组织中的表达水平和对照组相比无统计学差异。TDP－43蛋白也出现在其他神经系统变性病中，与在MND中的广泛沉积相比，TDP－43蛋白在其他神经变性病和正常衰老大脑中仅在边缘系统呈局灶沉积，提示TDP－43蛋白的病理改变虽已不再具有疾病特异性，其分布模式还是与特定疾病相关。

TDP－43蛋白沉积和MND其他病理改变之间的关系目前尚无定论。尽管在出现TDP－43阳性包涵体的部位运动神经元脱失更为显著，但神经元脱失出现在所有sMND中，而在所有神经元胞质内的包涵体中TDP－43蛋白的阳性率尚不足50%［1，11］。TDP－43阳性包涵体和 Bunina小体关系密切，在对18例尸检的MND病例中均发现存在TDP－43包涵体，其中15例存在Bunina小体，出现Bunina小体和TDP－43包涵体的前角细胞占据前角细胞总数的比例分别为17.1%和46.4%。在出现Bunina小体的神经元中，其TDP－43阳性包涵体的出现率高于不出现Bunina小体的神经元，超微结构观察显示TDP－43阳性的细丝样结构和Bunina小体早期结构相互交联［11］。尽管TDP－43蛋白是泛素阳性包涵体的主要成分，但二者的表达也并非完全平行。在sMND患者下运动神经元线团样和圆状包涵体、海马齿状回颗粒细胞、新纹状体小神经元的圆状和半月形包涵体内，TDP－43蛋白和泛素共同表达，而在苍白球、丘脑、皮层运动神经元以及胶质细胞TDP－43阳性包涵体中，仅有微弱或者无泛素表达［1］。在海马齿状回颗粒细胞泛素阳性包涵体中，TDP－43阳性包涵体的数量和频率最多。此外在FTLD－MND患者中，TDP－43阳性包涵体出现在Tau蛋白沉积之后，且与磷酸化Tau蛋白在病理分布方面并不具有平行性［12］。

3 TDP－43蛋白和MND相关基因

不同基因突变导致的MND中可以存在或缺乏病理性 TDP－43蛋白。携带SOD1突变的fMND中无TDP－43蛋白表达，而TDP－43蛋白编码基因TARDBP的突变出现在4%的fMND和约1%～5%的sMND 中［13］，其主要 病 理 改变 为TDP－43蛋白病。位于16号染色体上的肉瘤融合基因（fused in liposarcoma，FUS）编码的 FUS蛋白出现在一小部分MND和泛素阳性的FTLD患者中，其神经元内包涵体的TDP－43蛋白、Tau蛋白和共核蛋白表达均为阴性［14］。2011年发现的位于Chr9p21的C9ORF72基因为一高度保守序列，该基因非编码区突变导致的六核苷酸重复扩增序列GGGGCC是 MND、FTLD－MND及 FTLD的重要遗传改变，携带该突变的患者主要病理改变为TDP－43蛋白病［15］。

此外，研究者们在另一TDP－43蛋白病FTLD中依据表型描述了4种TDP－43蛋白病理类型，其中A型与编码分泌型生长因子Progranulin的基因GRN突变有关，后者是家族型FTLD最常见突变。B型与FTLD－MND有关，C型与语义性痴呆有关，D型和编码含缬酪肽蛋白（valosin containing protein）的VCP基因突变有关［16］。值得指出的是尽管GRN突变在MND中少见，仍有研究发现GRN的常见变异是TDP－43蛋白异常表达的遗传易感因素。而VCP基因突变的表型除了FTLD外还包括包涵体肌炎和Paget骨病，在后两者中亦发现了TDP－43蛋白在肌肉的表达。因此，尽管目前尚不能明确TDP－43蛋白与大多数MND基因及其编码蛋白之间的相关性，但这些改变的出现提示不同基因异常导致MND发病的过程可能均有TDP－43蛋白参与。

4 TDP－43蛋白在MND中的致病机制

与SOD1在MND中的致病学说类似，TDP－43蛋白的致病学说也主要存在2类观点。一些学者认为该蛋白的毒性作用源于其正常功能的丧失，TDP－43蛋白在细胞核中主要参与基因的转录及RNA的剪切，可以连接并稳定神经丝轻链基因的mRNA，TARDBP基因敲除后，TDP－43蛋白能够自由与其他mRNA底物相互作用，最终导致神经元死亡。体外实验显示敲除TARDBP基因的细胞系也出现了细胞核形态异常、树突生长异常及细胞周期的调节异常并导致细胞死亡［4－5，17］。上述发现表明生理性TDP－43蛋白对于维持正常突触功能及应对细胞应激反应至关重要。另一些学者认为TDP－43蛋白的毒性作用源于其异常功能的获得。在过表达人全长TDP－43蛋白及各种TDP－43剪切体的酵母中，只有包含不完整RRM结构域或形成聚集体的TDP－43蛋白具有毒性作用，表明TDP－43蛋白的异常聚集使其获得了毒性功能［17］。研究者将突变的人TARDBP基因转染到大鼠黑质，TDP－43蛋白主要表达于细胞核，神经元胞质中出现了弥漫性或颗粒样的表达，伴随胶质增生、神经元变性以及进行性运动功能障碍等类似MND的表现，但在神经元中并未发现成熟的包涵体结构，提示在不形成聚集体的情形下，TDP－43蛋白仍具有神经元毒性。支持这一观点的更有力证据为，在TDP－43蛋白的动物实验中成功复制了在SOD1转基因小鼠中的实验结果，即过度表达野生型TDP－43蛋白和携带TARDBP基因突变的转基因小鼠一样具有神经毒性，导致运动障碍和神经细胞变性［18］。

总之，TDP－43蛋白已经被确立为MND的特征性病理沉积蛋白，越来越多的证据表明，TDP－43蛋白在MND中的出现具有致病意义，和SOD1相比TDP－43蛋白更具有代表性，更广泛表达于不同遗传背景和不同表型下的MND中。TDP－43蛋白的发现拓宽了人们对MND的认识，围绕TDP－43蛋白进行的体内和体外实验有可能进一步阐释MND的发病机制，并将加快对MND乃至一系列神经变性病发病机制的研究进程。

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