140例维吾尔族青壮年肺结核合并肺原性心脏病患者的临床分析
2013-01-22商勇何涛迪拉拉吐尔逊沙吉旦牙生陈小玉
商勇 何涛 迪拉拉·吐尔逊 沙吉旦·牙生 陈小玉
都伟欣 陈保文 徐苗 杨蕾 卢锦标 王国治
柳正卫 黄玉 赵雁林
路希维
·论 著 ·
140例维吾尔族青壮年肺结核合并肺原性心脏病患者的临床分析
商勇 何涛 迪拉拉·吐尔逊 沙吉旦·牙生 陈小玉
目的 分析维吾尔族青壮年肺结核合并肺原性心脏病（简称“肺心病”）的临床特点和治疗情况。方法对2010—2012年间新疆喀什地区第一人民医院收治的140例年龄在20～55岁的维吾尔族青壮年肺结核合并肺心病患者的病程、临床特点、治疗情况进行回顾性分析。结果 140例患者中，咯血28例，肺部有啰音140例，肺气肿征象68例，肝脏肿大、下肢水肿81例，胸腹腔积液45例。心电图诊断肺心病62例，其中肺型P波者60例，肢体导联QRS低电压59例，心律失常51例。心脏彩色超声诊断肺心病78例。140例患者经过治疗，好转121例，死亡19例。结论 维吾尔族青壮年肺结核合并肺心病患者临床症状不典型，需要及时发现和规范诊治，降低死亡率。
结核，肺/并发症； 肺心病； 青年人； 维吾尔族
慢性肺原性心脏病（简称“肺心病”）是指肺、胸部或肺部血管疾病引起的肺动脉高压，右心室肥大，最后发展为右心衰竭的一种心脏病。其病因很多，慢性支气管炎为最多见，肺结核次之。肺结核引起的肺心病占所有肺心病的11%～18.2%［1］，是肺结核患者主要死亡原因之一。老年肺结核患者合并肺心病已引起临床医师的高度重视，但青壮年肺结核患者合并的肺心病由于临床症状不典型、心电图检查正常等往往更易被忽略，导致漏诊、误诊，从而延误心衰的治疗。有资料显示，青壮年肺结核合并肺心病占所有肺结核合并肺心病患者的20%［2］。笔者对我院2010—2012年间收治的维吾尔族青壮年肺结核合并肺心病患者的临床特点进行回顾性分析，为该病能够得到早期诊断和治疗，及寻找预后的影响因素提供帮助。
资料和方法
一、资料来源
2010—2012年我院收治的肺结核合并肺心病住院患者693例，其中679例为维吾尔族患者（98.0%），14例为汉族患者（2.0%），对679例维吾尔族患者中的140例维吾尔族青壮年（20～55岁）患者的资料进行分析整理。140例维吾尔族青壮年患者的平均年龄为（38±6）岁，男84例，女56例，结核病病程5～8年（肺结核病程超过3年的患者114例），结核病合并肺心病病程2～4年。根据中华医学会结核病学分会的《肺结核诊断和治疗指南》的标准［1］，接受规范抗结核治疗者51例，不规范治疗者89例。
二、诊断标准
肺结核的诊断根据参考文献［1］；肺心病的诊断根据参考文献［3］。本组患者均符合以下诊断及选例标准：（1）有长期肺结核病史；（2）有心功能不全的症状或体征，尤其是右心衰竭体征；（3）右心室肥大或右下肺动脉横径＞15 mm或肺动脉段高度＞3 mm；（4）心电图或心脏B超证实者。
三、临床检查
1.实验室检查：对所有患者进行实验室检查，确定血白细胞是否升高（即＞1.0×109/L），红细胞沉降率是否加快（即＞20 mm/1 h）；痰涂片查抗酸杆菌，标本采集为痰液、超声雾化导痰、下呼吸道采样、支气管冲洗液。涂片检查采用萋-尼抗酸染色法。动脉血气分析：采血部位为桡动脉，抽血1～1.5 ml，肝素抗凝；化验单上注明吸氧浓度。
2.胸部X线检查：140例患者均行胸部X线检查。肺结核典型的X线胸片表现为：病变位于肺结核的好发部位，即为上叶尖后段及下叶背段，阴影形态为斑片、浸润、结节及融合影像，病变可按肺段分布，常伴有播散及空洞。肺心病的X线胸片表现为肺动脉段膨出，右下肺动脉增粗（横径≥15 mm，或右下肺动脉横径与气管横径比值≥1.07，或动态观察其横径增宽＞2 mm）；肺动脉高压显著时，肺动脉可呈截断或鼠尾状；右心室流出道增宽时，表现为肺动脉圆锥部显著突出。影像学资料由至少2名医生阅片，差异通过共同讨论最后确定诊断。
3.心电图检查：所有患者均常规记录心电图，查是否有肺型P波、右心室肥厚、重度顺时针转位，及肢体导联QRS低电压等。
4.心脏彩色超声（简称“彩超”）检查：对出现右心功能不全、呼吸衰竭及心电图有肺型P波，肢体导联QRS低电压，心律失常等改变患者行心脏彩超检查，以确定是否有右心室肥厚、肺动脉增宽。
四、治疗
肺心病的治疗及好转的判定标准按照文献［3］。结核病的治疗及好转的判定标准参照文献［4-5］。
结 果
一、临床分析
本组140例患者中，咯血28例，肺部有啰音140例，有肺气肿征象68例，肝脏肿大、下肢水肿81例，胸腹腔积液45例。
实验室检查血白细胞及中性粒细胞升高46例；血红细胞沉降率加快92例；查痰找抗酸杆菌阳性21例，阴性119例；动脉血气分析Ⅱ型呼吸衰竭98例，Ⅰ型呼吸衰竭42例。
X线胸片病变超过3个肺野者102例（肺野划分按照两肺上中下共6个肺野划分的方法），肺单侧损坏者87例，肺双侧损坏者53例，合并结核空洞者65例，伴结核性胸膜炎或胸膜肥厚者79例，有肺大泡者87例。心电图诊断肺心病62例，其中肺型P 波60例，肢体导联QRS低电压59例，心律失常51例，缺血改变42例。通过彩超诊断肺心病78例，心脏彩超检查显示，右室壁厚度平均为4.2 mm，肺动脉压力平均56 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa），最高可达90 mm Hg。
二、治疗及预后
本组140例患者均使用左氧氟沙星（0.5 g/次，1次/d）、头孢霉素（根据患者情况调整剂量）控制肺部感染，同时根据上述指南进行抗结核治疗；使用氨茶碱解痉平喘，并给予氧气吸入治疗；其中38例患者使用强心剂地高辛（异羟基洋地黄毒苷）0.125 mg/次，1次/d，同时口服或间断给予西地兰（去乙酰毛花苷注射液）0.2 mg/次静脉推注（每天1次或每天多次），利尿剂速尿（呋塞米）20～60 mg/次静脉推注或泵入（每天1次或每天多次）。140例患者经过上述治疗病情好转，血气变化：PO2上升约20～30 mm Hg，PCO2下降至正常水平（＜50 mm Hg），右心功能不全改善，双下肢水肿减退，肝脏肿大消失。同时患者自觉呼吸困难、心悸、纳差明显好转。心脏彩超显示肺动脉压力下降约20 mm Hg。好转后定期进行门诊随访，每月随访1次，复查 X线胸片及心电图。本组患者121例好转，19例死亡。
讨 论
肺结核不仅破坏肺组织，还会合并肺气肿、肺局限性或广泛性纤维化、胸膜增厚，使肺功能受损，导致低氧血症，引起肺小血管收缩。上述肺部病理改变引起肺血管狭窄或受压，使肺血管面积减少，从而造成肺动脉系统阻力增加，产生肺动脉高压。进而发展为右心室肥厚，最终导致右心衰竭。
文献［6］显示：青年、壮年活动性肺结核和涂阳肺结核患病率均逐渐升高，青壮年肺结核占肺结核患者总数的70.3%；因新疆喀什地处边疆偏远地区，患肺结核的多为维吾尔族农民，文化水平较低，对疾病的认识程度不够，且受经济条件限制，维吾尔族青壮年患者患病率仍较高。
本组资料显示，140例患者中肺结核病程超过3年者达114例，占总数的81.4%；受累肺野超过3个者达102例，占总数的72.9%；伴有空洞者65例，占总数的46.4%。青壮年肺结核发生肺心病主要与肺结核的病程及病灶所累及的范围有关，病灶累及范围越广，发病率越高。
肺结核合并肺心病的早期诊断较困难，尤其对于青壮年患者，由于临床症状不典型，更易误诊。肺结核患者的肺部组织不均匀纤维化，对周围组织产生牵拉，使心脏在胸腔的解剖位置发生改变，所以部分患者的右心室肥厚和电轴右偏，不能在心电图中表现出来［2］。此外，也有资料显示，青壮年肺结核的误诊率几乎达50%［6］。一些患者直到发生了心力衰竭后才得以确诊，由此对病程较长的或病变较广泛的患者要警惕发生肺心病的可能。本组资料显示，78例患者心电图不典型。故及时发现原发病，并给予合理有效的治疗，不但可以大幅度地减少肺心病呼吸衰竭的发生，还可以从根本上杜绝结核分枝杆菌的再传播。本组患者痰检阳性只有21例，119例痰检为阴性，痰检阳性率只有15.0%，较低的原因可能是：（1）留取标本方法不正确；（2）留取标本后放置的时间过长；（3）实验室监测的技术水平较低。
肺结核合并肺心病关键在于对肺结核的及时发现和进行正规治疗，并积极处理并发症，防止病情反复加重和病程迁延。对于肺组织广泛纤维化的患者，除给予必要的抗结核治疗外，重点应与防治慢性阻塞性肺疾病一样，积极预防和治疗感冒及慢性支气管炎，减少继发感染，从而防止肺心病的发生、发展和急性加重，降低死亡率。
［1］中华医学会结核病学分会.肺结核诊断和治疗指南.中华结核和呼吸杂志，2001，24（2）：70-74.
［2］董守元，祁停妹，黄汉平，等.肺结核致肺心病的心电图漏诊原因分析.中国心脏起搏与心电生理杂志，2000，14（3）：203.
［3］中华医学会.临床诊疗指南呼吸病学分册.北京：人民卫生出版社，2009：18-19.
［4］中华人民共和国卫生部疾病预防控制局，中华人民共和国卫生部医政司，中国疾病预防控制中心.中国结核病防治规划实施工作指南（2008年版）.北京：中国协和医科大学出版社，2009.
［5］肖和平.耐药结核病化学治疗指南.北京：人民卫生出版社，2010.
［6］全国第五次结核病流行病学抽样调查技术指导组，全国第五次结核病流行病学抽样调查办公室.2010年全国第五次结核病流行病学抽样调查报告.中国防痨杂志，2012，34（8）：458-507.
（本文编辑：郭萌）
·专 家 论 坛 ·
结核分枝杆菌IFN-γ体外检测试剂的生产质量控制与临床研究探讨
都伟欣 陈保文 徐苗 杨蕾 卢锦标 王国治
【摘要】依据《体外诊断试剂注册管理办法（试行）》等相关的法律法规，分别针对结核分枝杆菌IFN-γ（interferon gamma，γ干扰素）体外检测试剂盒的主要原材料、生产工艺、产品质量控制，以及临床研究的技术要求进行了概述，为该类试剂盒的研发和注册提供技术支撑。
【关键词】分枝杆菌，结核； γ干扰素释放试验； 试剂盒，诊断； 质量控制
【Abstract】According to Management Method of In Vitro Diagnostic Reagents Registration（Interim）and other relevant laws and regulations，we summarize respectively the main raw materials，production process，product quality control and technical requirements of clinical study for in vitro Mycobacterium tuberculosis IFN-γdetection kits and provide technical support for the development and registration for such kits.
【Keywords】Mycobacterium tuberculosis； Interferon-gamma release tests； Reagent kits，diagnostic； Quality control
结核分枝杆菌γ干扰素（interferon gamma，IFN-γ）体外检测试剂盒主要是通过检测特异性IFN-γ的释放来辅助诊断结核病或判定机体是否已经感染结核分枝杆菌的一种体外诊断方法［1］。由于检测方法的不同，结核分枝杆菌IFN-γ体外检测试剂盒包含两种类型，一种是应用酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）来定量检测特异性IFN-γ的释放水平；一种是应用酶联免疫斑点法（enzyme linked immunospot assay，ELISPOT）在单细胞水平定量检测分泌IFN-γ的效应性T细胞。尽管两类试剂盒的检测方法稍有差异，但其工作原理基本相似，检测用途一致。笔者将针对两类试剂盒的主要原材料、生产工艺、产品质量控制，以及临床研究的技术要求进行概述，为从事结核分枝杆菌INF-γ体外检测试剂盒人员提供参考。
原材料
一、主要生物材料
主要生物原料包括IFN-γ抗体、相关酶标记IFN-γ抗体、IFN-γ标准蛋白、结核特异性刺激物（重组抗原或合成多肽）、阳性对照刺激物（刀豆蛋白或植物血凝素）等。这类原料主要用于包被酶标反应板、刺激特异性IFN-γ释放、检测IFN-γ、制备校准品（标准品）等。
主要生物原料若为企业自己生产，应简述其制备程序。IFN-γ抗体和相关酶标记IFN-γ抗体应提供各级细胞库的详细制备过程和检定情况，以及抗体的生产工艺条件等资料。相关酶标记IFN-γ抗体还需提供标记酶的来源，标记方法和酶标记抗体的质量鉴定情况。结核重组抗原应提供工程菌的构建、各级种子库的制备，生产工艺条件等项资料，以确保工艺相对稳定。IFN-γ标准蛋白如为重组来源产品，也需提供工程菌的构建、各级种子库的制备，生产工艺条件等项资料。
结核合成多肽应提供其合成方法、生产工艺条件和检定情况等项资料。刀豆蛋白和植物血凝素一般为商购原料。
以上生物原料若购买，其供应商要求相对固定，不能随意变更供应商。如生产工艺或供应商等有变更，应依据国家相关法规的要求进行变更申请。
主要生物原料的常规检验项目一般包括：外观、纯度、相对分子量、蛋白质浓度、效价和功能性实验（至少应有阳性参考品符合率、阴性参考品符合率和最低检出限），应符合企业生产规定的要求。标记用酶若为辣根过氧化物酶，酶的纯度RZ值（德文Reinheit Zahl）应不低于3.0［2］。
二、生物辅料
生物辅料一般指在生产过程中作为蛋白保护剂用途的一类生物原料，主要包括小牛血清和牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）等。其中牛血清的检定项目至少应包括：外观、无菌试验、总蛋白含量和球蛋白含量等，BSA的检定项目至少应包括：外观、溶解性、总蛋白含量、总蛋白中的BSA含量、BSA的净含量等，质量标准应符合2000年版的《中国生物制品主要原辅材料质控标准》［3］规定的标准要求。此外，这些生物辅料还应进行功能性实验，即以其为原料配制一定浓度的稀释液作为样品进行测定，均不能出现非特异性反应。
三、化学原材料
化学原材料的质量标准参照文献［3］分析纯级别进行检验，主要的检测指标包括：外观、一般盐类检测、溶液p H值、溶解情况、干燥失重、炽灼残渣等。在购入时，生产商必须提供该批次化学原材料的质量保证材料和质量检验报告。
四、其他物料
1.酶标板或聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜板：酶标板或PVDF膜板应进行外观、吸附能力和精密性等的检测。吸附能力和精密性应采用合适的方法进行检验，一般用一定浓度的鼠IgG包被板条，再用一定浓度的羊抗鼠IgG-HRP与其进行反应，通过酶标仪读数，计算不精密性（coefficient of variation，CV），一般规定CV（%）应不高于15%。
2.液体试剂装量瓶：各液体试剂应有相应的装量瓶，并建立相应的质量控制标准，如装量瓶的规格、装量瓶的颜色、瓶盖的颜色等。一般规定装量应不低于标示量。
3.其他材料：包括试剂瓶标签、黏胶纸、铝箔袋、衬垫、可密封塑料袋、说明书、干燥剂和包装外盒等，应参照国家食品药品监督管理局颁布的《体外诊断试剂说明书编写指导原则》［4］和《医疗器械说明书、标签和包装标识管理规定》［5］建立相应质量控制。
主要生产工艺
一、半成品的制备程序
IFN-γ抗体制备通常采用IgG亲和层析或其他适宜方法进行；相关酶标记IFN-γ抗体的制备通常采用常规过碘酸钠-乙二醇法或其他适宜方法进行酶标记；重组来源的IFN-γ标准蛋白和结核特异性刺激蛋白通常应用不同层析方法的组合来进行制备，以保证其纯度能≥95%；结核特异性合成多肽通常应用固相合成的化学方法或其他适宜方法进行制备，以保证多肽在结构和纯度方面达到质量要求。
包被IFN-γ抗体浓度和酶标记IFN-γ抗体工作浓度的选定通常采用方阵滴定法进行；研究还应包括对包被液及包被条件，封闭液及封闭条件，干燥条件进行优化，以保证包被液能使IFN-γ抗体很好地与PVDF膜结合，封闭液能很好的封闭PVDF膜上多余的结合位点，干燥条件保证在工作过程中抗体不会从固相载体上脱落；其余如反应板、阳性对照刺激物、酶结合物或酶稀释液、底物或底物缓冲液、终止液等要保证其稳定性符合产品要求。特别应注意的是，若以上液体组分涉及生物安全性问题，制备时应在相应的生物安全实验室完成。
应对包被抗原板按半成品质量控制的标准进行抽样检定，并应符合相应项的规定要求。各种工作液应有明确的配方及严格的配制程序，其质量控制主要包括酶结合物的功能性实验及稳定性；各种溶液的外观、p H值等；酶作用底物应测定在无相应酶的情况下自身显色的情况，并制定合理的限定指标；终止液应对其终止酶促反应的能力进行测定。对于定量检测试剂，其标准品（或校准品）溶液应具有量值溯源性。
二、成品的分批、分装和包装
按照文献［2］中《生物制品分批规程》、《生物制品分装和冻干规程》以及《生物制品包装规程》进行分批、分装与冻干以及包装。
质量控制
一、半成品质量控制
以企业参考品进行半成品质量控制。ELISPOT方法检测的试剂盒检定项目至少应包括阴性参考品符合率、阳性参考品符合率和精密性。ELISA方法检测的试剂盒检定项目除阴性参考品符合率、阳性参考品符合率和精密性检定项目外，还应包括线性检测和最低检出量检测项目。
阴性参考品和阳性参考品至少各5份，精密性参考品至少1份。
二、成品质量控制
（一）出厂检验
ELISPOT方法的成品质量控制应包括外观、阴性参考品符合率、阳性参考品符合率和精密性检测项。
ELISA方法的成品质量控制除以上4项外，还应包括最低检出量、线性、准确性和稳定性等检测项。
两种检测方法，无论是应用新鲜血样还是冻存的细胞、冻存的培养上清或冻存的血浆，其阴性参考品符合率应不低于75%，阳性参考品符合率应不低于75%，精密性检测项的CV值应不低于30%。其他质控指标可参照型式检验中的有关检测项进行，或生产企业视质量控制情况而定。
（二）型式检验
由于该类试剂检测使用血液样本新鲜程度影响其检验结果，并且目前尚无供评价用的国家参考品，在进行国家规定检验或抽验时使用由第三方收集的血液样本进行质量评价，企业成品质量控制技术指标应考虑以下几点要求。
Ⅰ.检验用样本的基本要求
（1）应根据该试剂使用说明确定样本的采集量与采集用容器。精密性检测用参考品如需使用新鲜血液，建议其采集数量大于注册标准中的规定数量。（2）阳性参考品中菌阳参考品宜采用1个月内确诊的痰涂片阳性和（或）培养阳性的结核病患者的血样；菌阴参考品采用1个月内痰涂片阴性和（或）培养阴性的临床疑似结核病患者的血样，如在随后的最终诊断为非结核病患者，则应给予剔除。由于阳性参考品存在被剔除的可能性，建议其采集数量大于注册标准中的规定数量。（3）阴性参考品应依照随机原则采集无结核病临床症状的健康志愿者的外周静脉血，采血后立即进行TB-PPD皮试或鉴别诊断用超敏反应原的同体双臂皮肤试验，24～72 h后观察并记录结果。（4）送检厂家负责运输参考品血样，建议在采血后的2 h内，最长不超过6 h送至中国食品药品检定研究院承检科室。同时附送样品来源的详细资料，应包括阳性参考品的涂片和（或）培养的检测结果，应提供分装规格和分装数量的数据。
Ⅱ.检测项目
1.物理检查：应对试剂盒外观、试剂盒中各液体组分（如阴阳性对照、样品稀释液、洗涤液、酶结合物或酶稀释液、底物液、终止液等）以及酶标板或PVDF板外观等进行检查，应符合相应的质量标准。
2.阳性参考品符合率：至少10份以上结核分枝杆菌涂片和（或）培养阳性的结核病患者（菌阳）的新鲜外周抗凝血样本；至少10份以上结核分枝杆菌涂片和（或）培养阴性的临床确诊结核病患者（菌阴）的新鲜外周抗凝血样本，其阳性参考品符合率应不低于75%。
3.阴性参考品符合率：至少15份无结核病临床症状的健康志愿者的新鲜外周抗凝血样本，其阴性参考品符合率应不低于75%。具体要求：无结核病临床症状的健康志愿者应包含不同等级的PPD皮试人群，即应包含PPD皮试强阳性者（72 h硬结或红晕直径≥15 mm或伴有水泡）、PPD皮试阳性者（72 h硬结或红晕直径≥5 mm）和PPD皮试阴性者（72 h硬结或红晕直径＜5 mm）这3种类型。
4.精密性：（1）ELISPOT方法的精密性检测：①批内精密性。如精密性参考品为新鲜血样，则需取至少1例临床确诊的结核分枝杆菌涂片和（或）培养阳性患者样本进行检测，样本在1个批次内进行至少10次重复性实验，CV值应不高于25%。考虑到样本为新鲜血液，1份样本很难满足3个批次的用量，可以取3份样本分别进行3个批次的实验。如精密性参考品为企业冻存的外周血单个核细胞样品，则需要复苏细胞后进行检测，样本在1个批次内进行至少10次重复性实验，CV值应不高于25%。此实验是以斑点数来计算CV值，建议精密性样品的斑点数能控制在30～150个之间。②批间精密性。如样本为新鲜血液，1份样本很难满足3个批次的用量，可以不做批间精密性检测。如企业送检参考品为冻存的细胞样品，则可以进行此项检定，批间的CV值应不高于30%。各生产企业可视质量控制情况而定。（2）ELISA方法的精密性检测：应用刺激后血浆或者企业送检的精密性参考品作为样品进行检测，每批次至少重复测试10次，连续测试3个批次，计算CV值，批内和批间的CV值均应不高于20%。
5.最低检出量：应以相应的参考品或者参考品的稀释液为样本，平行测定至少10份，计算其吸光度值（A值）的均值和标准差（SD），利用剂量-反应曲线计算出“A值均值+ 2SD”时对应的浓度值为最低检出量。或者以研究数据结果直接定出最低检出量。各生产企业可视质量控制情况而定。
6.线性：在线性范围内，相关系数R2应不低于0.98。
7.准确性：在线性范围内，以国际标准品（或企业校准品）为准确性参考品进行检测，参考品的实测值与标识值的偏差应在±20%范围内。或者以其他适宜方法进行检测。
8.稳定性：稳定性的检测可以用热稳定性试验来替代，温度一般选（37±1）℃，放置时间可根据试剂盒的效期而定，一般有效期6个月的产品37℃加热3 d，有效期12个月的产品37℃加热至少6 d，有效期18个月的产品37℃加热至少9 d。然后进行“1～7”的检测项并符合规定。
ELISPOT方法检测试剂盒需进行“1～4”的检测项，ELISA方法检测试剂盒需进行“1～8”的检测项。
临床研究
一、基本原则
1.基本要求：结核分枝杆菌IFN-γ体外检测需采用血液进行，采集时应征求受试者的同意，并签署知情同意书。
2.临床研究单位及人员的要求：结核分枝杆菌IFN-γ体外检测试剂的临床研究一般应在至少2家以上（含2家）设有结核病专科的省级（或直辖市）医疗卫生单位完成。
临床研究单位必须具有相应专业的技术人员，必须具有与研究试剂相适应的仪器设备（ELISPOT读板仪除外）。
二、临床研究设计原则
1.结核病确诊标准：依据《肺结核诊断标准 WS288-2008》［6］，肺结核的诊断是以细菌学实验室检查（涂片、培养）为主，结合胸部影像学、流行病学、临床表现，以及结核菌素试验和组织病理检查等必要的辅助检查与鉴别诊断，进行综合分析作出的。
2.研究对象的选择与评价：无论是“新诊断试剂产品”和“已有同品种批准上市产品”临床研究实验对象的选择均应符合《体外诊断试剂临床研究技术指导原则》中“1.3项”的规定，即研究对象应包括两组：一组是用金标准确定为有某病的患者组；另一组是用金标准证实无该病的患者或正常人群，作为对照组。患者组应包括该病种的不同患者，如症状典型和非典型的，病程早、中、晚期的，病情轻、中、重型的，不同年龄层次的，等等，以便能反映该病的全部特征。对照组应包括确定无该病的患者，且易与本病相混淆疾病的患者。
针对该类试剂盒的特点，笔者建议其临床实验对象的选择应与上市后临床拟使用人群相一致。疑似结核病患者入组后，依据《肺结核诊断标准WS288-2008》［6］进行诊断，将接受医嘱一个疗程化疗者列为结核病患者组，用于评价产品敏感度；其余列为非结核病患者组，用于评价产品特异度。在实验结束仍有极少数无法诊断结核病者可予以剔除。
鉴于该类试剂盒有诊断结核分枝杆菌潜伏感染人群的功能，因此建议增加正常人群为对照组，对该人群检测特异性干扰素的同时进行PPD皮肤实验或其他适宜的免疫学方法检测，以便于了解当地结核病流行的背景资料，并且还能进行试剂盒诊断结果与PPD皮肤实验或其他适宜方法诊断的阴性、阳性、强阳性等不同等级人群的相关性分析。
临床评价结束后，以结核病患者组来计算试剂盒的诊断敏感度；而非结核病患者将与正常人群合并为实验对照组，用来计算试剂盒的诊断特异度。其中结核病患者组建议可进行以下分析：结核病患者（含菌阳与菌阴患者）阳性检出率分析；菌阳样本［涂片和（或）培养阳性］的总检出率分析、菌阴样本［涂片和（或）培养阴性］的总检出率分析；菌阳样本还可分别进行涂片阳性与培养阳性样本的阳性检出率分析，如有必要还可进一步进行涂阳培阳、涂阴培阳、涂阳培阴的详细分析。
对部分特异性干扰素检测为阴性的结核病患者，建议对其免疫学状态、年龄、体质、是否使用免疫抑制剂等可能影响检测结果的因素进行分析。对部分细菌学为阳性、特异性干扰素检测为阴性的结核病患者，宜进行分型检测，分析是否为非结核分枝杆菌所致。
临床评价中采用已批准上市的同类产品作为对比试剂时，应以对结核病患者与非结核病患者的临床诊断标准作为评价指标，比较两种试剂的敏感度与特异度的差异有无统计学意义。
3.样本量：依据《体外诊断试剂注册管理办法（试行）》［7］第十二条规定，结核分枝杆菌IFN-γ体外检测试剂属第三类产品。《体外诊断试剂临床研究技术指导原则》［8］中关于临床研究样本量的规定：第三类产品的临床研究的总样本数至少为1000例。
4.样本的采集：以肝素钠或肝素锂抗凝的采血管进行样本采集。不建议采用乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝的采血管进行样本的采集，这将会增加背景，从而对结果判读造成干扰。
5.对比试剂：应选择使用已经通过我国相关机构认证的同类型产品，同时应充分了解所选择产品的技术信息，包括方法学、临床使用目的和范围、主要性能指标、标准品或校准品的溯源情况、推荐的参考值（参考范围）等，以便对试验结果能够进行科学的分析。
关于临床研究报告的撰写
临床研究报告的格式及书写内容应包括以下项目。
一、首篇
首篇是每份临床研究报告的第一部分，所有单个的临床研究报告均应包含该部分内容。主要有封面标题、目录、研究摘要、试验主要研究人员的姓名、单位和在研究中的职责及其简历（列于附件中）、缩略语等。
二、正文内容和报告格式
1.基本内容：应包括引言、研究目的、试验管理、试验设计、临床研究结果及分析、讨论和结论等。其中试验设计中应包括：样本量及样本量确定的依据；样本选择依据、入选标准、排除标准和剔除标准；样本采集、保存、运输方法等；金标准或对比试验产品的确立；临床研究用所有产品的名称、规格、来源、批号、效期及保存条件，对比试验产品的注册情况；质量控制方法；临床研究数据的统计分析方法；研究过程中方案的修改。
2.情况说明：有关临床研究中特别情况的说明。
3.附件：应包括临床研究中所采用的所有诊断试剂产品的使用说明书、临床研究中的所有试验数据，以及主要参考文献等。
讨 论
以上文章中的“原材料、主要生产工艺、质量控制和临床研究”四部分主要是针对我国相关试剂和试剂盒的研究进行的探讨。如国外同类试剂或试剂盒在我国进行注册申请，需符合《体外诊断试剂注册管理办法（试行）》［7］的相关规定。《体外诊断试剂注册管理办法（试行）》第十条规定“境外生产企业还应当符合生产国或地区相应的质量管理体系要求。”《体外诊断试剂注册管理办法（试行）》第三十二条规定“申请境外产品注册，需要提供境外的临床试验资料。申请人应当按照临床试验的要求，同时考虑不同国家或地区的流行病学背景、病原微生物的特性、不同种属人群所适用的正常参考值（或参考范围）等诸多因素，在中国境内进行具有针对性的临床试验。”因此，如国外同类试剂或试剂盒在我国进行申请注册，临床研究可参考文章中的相关部分。至于国外同类试剂或试剂盒的进口注册检定，要求与国内同类制品一样，可参考上述“型式检验”部分。
参 考 文 献
［1］Centers For Disease Control and Prevention.Updated guidelines for using interferon gamma release assays to detect Mycobacterium tuberculosis infection——United states，2010.Atlanta：Centers For Disease Control and Prevention，2010：59（RR-5）.
［2］中华人民共和国国家药典委员会.中华人民共和国药典三部.北京：中国医药科技出版社，2010：333.
［3］中国生物制品标准化委员会.中国生物制品主要原辅材料质控标准.北京：化学工业出版社，2000.
［4］中华人民共和国国家食品药品监督管理局.体外诊断试剂说明书编写指导原则.北京：中华人民共和国国家食品药品监督管理局，2007.
［5］中华人民共和国国家食品药品监督管理局.医疗器械说明书、标签和包装标识管理规定.北京：中华人民共和国国家食品药品监督管理局，2004.
［6］中华人民共和国卫生部.WS288-2008 肺结核诊断标准.北京：人民卫生出版社，2008.
［7］中华人民共和国国家食品药品监督管理局.体外诊断试剂注册管理办法（试行）.北京：中华人民共和国国家食品药品监督管理局，2007.
［8］中国防痨协会基础专业委员会.结核病诊断实验室检验规程.北京：中国教育文化出版社，2006.
（收稿日期：2013-06-12）
（本文编辑：薛爱华）
·综 述 ·
结核分枝杆菌基因突变检测方法研究进展
柳正卫 黄玉 赵雁林
【摘要】结核分枝杆菌全基因组测序工作的完成，为开展结核病基因研究提供了理论基础，对结核分枝杆菌基因突变的研究也成为当前结核病研究领域的热点之一。高分辨率熔解（high-resolution melting，HRM）、基因芯片、DNA直接测序等分子生物学新技术的发展和应用，为结核分枝杆菌基因突变研究提供了更有效的方法。现综合国内外近年来的文献，分类介绍应用于结核分枝杆菌基因突变检测的各种方法的原理、应用情况等，同时也对GeneXpert、结核分枝杆菌线性探针（line probe assay，LiPA）、基因芯片等当前比较成熟并有望得到广泛应用的商品化基因突变检测技术进行介绍。
【关键词】分枝杆菌，结核； 突变； 序列分析，DNA； 寡核苷酸序列分析
【Abstract】The completion of the Mycobacterium tuberculosis genome sequencing provides the evidence for the study of genetic nature of tuberculosis bacterium，and the study of Mycobacterium tuberculosis gene mutations has become one of hotspots in the field of TB research at present.The development and application of new technology of molecular biology，such as high-resolution melting（HRM），gene chip，DNA direct sequencing have provided more effective methods for Mycobacterium tuberculosis gene mutation research.This paper reviewed relative literatures in recent years at home and abroad，introduced in category the principles and application of different methods in Mycobacterium tuberculosis gene mutation detection.Gene mutation detection technology such as GeneXpert，Mycobacterium tuberculosis linear probe（line probe assay，LiPA），gene chip，which are more mature and are expected to be widely used at present were introduced as well.
【Keywords】Mycobacterium tuberculosis； Mutation； Sequence analysis，DNA； Oligonucleotide array sequence analysis
结核病是一种严重危害人类健康和社会发展的慢性传染病，自1993年WHO宣布全球紧急状态以来，结核病的疫情一直面临着多重挑战。H37Rv株的全基因组测序工作［1-2］的完成，使人们开始从分子水平认识和研究结核分枝杆菌的遗传本质，为开展结核病基因研究提供了理论基础，各种针对结核分枝杆菌耐药基因、毒力相关基因、遗传变异等方面的研究都取得了突变性进展，开发出的新诊断技术、新疫苗、新药物成为人类战胜结核病新的希望和机遇。这些新诊断技术、新疫苗、新药物的研究大多建立在结核分枝杆菌相关重要基因的突变和功能研究基础上，因此，对基因的突变研究显得尤为重要，成为当前结核病研究领域的热点。过去十几年，分子生物学的迅猛发展产生了多种结核分枝杆菌基因突变检测方法，这些技术依据检测原理可分成不同的种类。笔者就结核分枝杆菌基因突变检测方法做一综述，特别对近期出现的新技术进行详细讨论。
一、以构象为基础的检测方法
1.聚合酶链反应-单链构象多态性（PCR-single-strand conformation polymorphism，PCR-SSCP）：PCR-SSCP是1989年由Orita等［3］创建的筛查点突变的一种技术，是一种简单、快速、经济的点突变筛查手段。其基本原理是单链DNA在某一种非变性环境中会形成二级结构，这种二级结构依赖于其碱基组成，即使单碱基变化都能导致这种空间构象的改变导致在非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳迁移率不同，产生不同的泳动带，从而将正常链与突变链分离出来。该方法自发明后即被广泛应用于结核分枝杆菌耐药基因突变的检测［4-5］，直接用于痰标本耐药基因的检测也显示了较好的敏感度和特异度［6-7］。该技术只能明确存在碱基置换，而确定其碱基置换的性质必须经过DNA测序，是测序之前突变筛查的常用手段。
2.变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）：DGGE最初由Fischer等［8-10］于20世纪80年代初期发明，主要是用于检测DNA片段中的点突变。不同的双链DNA片段因为其序列组成不同，其解链区域及各区域的解链条件变性剂浓度也不同。同样长度但序列不同的DNA片段在递增的变性剂浓度梯度中电泳时，会在各自解链区域的变性剂浓度处发生部分解链，导致迁移率改变，而将组成不同的DNA片段分开。值得注意的是，DGGE在分析每一特定的PCR片段之前，需要通过预试验来确定其最佳的电泳条件，以获得最大的分离度。用DGGE检测结核临床标本利福平耐药，其基因型与测序结果符合率很高［11-12］。虽然该方法可以有效检测基因突变，但是，目前该方法更多地应用于微生物分子生态学研究的各个领域，成为研究微生物群菌落结构的主要分子生物学方法之一。
3.PCR-限制性片段长度多态性（PCR-restricted fragment length polymorphism，PCR-RFLP）：PCR-RFLP在结核领域最为人所熟知的应用就是其DNA-指纹技术应用于跨国结核病疫情的追踪［13］，而其原理就是特定的限制性核酸内切酶具有识别并剪切特定的DNA序列位点的能力。因此，特定的DNA被限制性内切酶水解后其片段长度发生变化，通过琼脂糖凝胶电泳可反映DNA特定区域的结构改变，如点突变、缺失、插入和重排等，从而体现出各样本间的差异性。该技术操作简便，仅为PCR加上限制性内切酶，复现性良好，可检出1个碱基的突变。研究者进行了一系列试验来检测结核分枝杆菌的耐药性，分析特定基因位点的点突变，结果显示该技术具有高度的特异度［14-16］。
二、以荧光共振能量传递为基础的检测方法
荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）是用于对生物大分子之间相互作用定性、定量检测的一种有效方法。当一个供体荧光分子的荧光光谱与另一个受体荧光分子的激发光谱相重叠时，供体荧光分子的激发能诱发受体分子发出荧光，同时供体荧光分子自身的荧光强度衰减，称为荧光共振能量转移。基于FRET的几种突变检测方法需要针对特定的突变位点或多态性位点设计并合成序列或位点特异性探针，因此，该类方法大多用于已知突变位点或是对位点的多态性较清楚的突变检测。
1.Taqman探针法：用于对特定位点单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）的检测。应用一对双标记Taqman探针，分别针对双等位SNP的不同基因型，只有完全匹配的探针扩增出各自对应的基因型；用两种荧光染料Fam、Hex（Vic）分别标记这两种探针，就可以在一次PCR反应中完成对单个SNP位点的基因型判定。
2.分子信标（molecular beacon）：分子信标是可以特异识别核酸序列的具有茎-环结构的寡核苷酸荧光探针，探针两端分别标上一个荧光基团和淬灭基团，两端的核酸序列互补配对，因此标记在一端的荧光基团与标记在另一端的淬灭基团紧紧靠近，并且不会产生荧光。当有靶序列存在的时候，靶序列和分子信标的探针序列杂交形成有一定刚性的双螺旋结构，导致分子信标的构象改变，干的部分打开，荧光基团与猝灭基团分开，二者之间的能量转移终止，在有相应的单色光激活时，荧光基团发出荧光。荧光强度与靶序列的多少成正比［17］。分子信标不仅可以用于基因的定量、定性检测，还可以用于基因点突变等的分析等。
三、异源双链结构分析为基础的方法
异源双链核酸是指来源不同的2种或2种以上的核酸分子同时存在于同一溶液中时，其同源区域可借碱基配对形成双链核酸。异源双链内由于存在碱基错配或不配区域，在链内局部可形成凸起或泡，在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中，其泳动速度变慢，双链同源性越高，其泳动越快。
1.异源双链分析法（heteroduplex analysis，HA）：突变型和野生型DNA形成的异源杂合双链DNA在其碱基错配处会形成1个突起，在非变性凝胶中电泳时，会产生与相应的同源双链DNA不同的迁移率，从而达到诊断碱基突变的目的。该法与SSCP相似，只适合于小片段的分析，所不同的是SSCP分离的是单链DNA，HA法分离的是双链DNA。但HA对一些不能用SSCP检出的突变有互补作用，两者结合使用，可使突变检出率提高。Saribas等［18］认为该方法有很高的敏感度和特异度，可以快速检测利福平耐药。
2.变性高效液相色谱技术（denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC）：DHPLC方法是一种检测基因突变的新方法，主要用来分析异质性双链结构。它利用野生型和突变型DNA形成异源双链，在变性条件下，依靠双链碱基组成的构象差异，最终表现为洗脱峰形的差异显示突变的有无来进行分析。该技术在结核分枝杆菌的耐药基因突变检测研究中得到了广泛的应用［19-21］。DHPLC突变检测技术是高通量筛选DNA序列变异的最新技术，在结核病研究领域，除耐药基因检测外，还可以用于基因分型、序列多态性分析等［22-23］，但是该技术所需设备价格昂贵，只能在一些大型的实验室中使用，限制了此方法的应用，同时，该技术只能检测杂合突变是其主要不足之处。在SNP筛查的检测通量、敏感度与成本等方面与最新的高分辨率熔解（high resolution melt，HRM）技术相比都明显落后。
3.Surveyor酶法：Surveyor酶是植物中提取的核酸内切酶，对DNA错配部位有高度选择性，它与普通的核酸内切酶不同，其酶切位点没有核苷酸序列的特异性，只识别异源双链中单个碱基错配形成的泡或未配对的多个碱基形成的环，从错配部位的每一条链的3′端切断双链DNA。无基因突变存在时，样本与野生型PCR产物杂交形成同源双链，Surveyor酶找不到酶切位点而不能发挥作用，电泳图谱上仅为1条带；有点突变存在时，杂交后产物为配位完好的同源双链和错配有凸起的异源双链。Surveyor酶可将异源双链从错配部位切开，电泳图呈现3条带，1条为同源双链条带，另外2条为被切断的异源双链，2条链的长度总和等于同源双链的长度。如果异源双链中有多个错配部位，则Surveyor酶可有多个作用位点，产生不同长度、不同种类的酶切片段，呈现多种带形的电泳图谱［24］。Surveyor酶法无需大型设备，仅使用普通的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳即可，也可通过琼脂糖凝胶电泳判断有无突变的存在。方法简便稳定，便于推广。该技术在其他疾病的基因突变中有较多的应用［25］，在结核耐药基因突变方面应用较少。
4.PCR-通用异源双链扩增子（PCR-universal heteroduplex generator，PCR-UHG）：Williams等［26］创立了并评价利用PCR-UHG技术快速检测结核分枝杆菌利福平耐药性的方法：先用巢式PCR扩增特异的rpoB基因片段，再与根据结核分枝杆菌rpoB基因Rif区合成的通用异源双链扩增子UHG探针杂交，如果标本中的结核分枝杆菌rpoB基因有突变，则会产生异源双链，通过电泳可分离异源双链，确定其是否有利福平耐药性。此方法对涂片染色阳性、未经治疗的患者尤为适合。Mayta等［27］进一步评价了该技术在发展中国家诊断痰涂片阳性肺结核和快速发现耐多药结核病的可行性，认为其具有高度的特异度、敏感度和预测值。
四、毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE）
CE是近几年发展起来的高效快速分离、分析技术。在散热效率高的极细的毛细管内，在有或无凝胶的筛分机制和高强度电场的双重作用下，DNA片段因离子表面积和分子外形的变异导致的迁移时间不同而检测突变。CE技术能够分析长至数千的碱基片段，可以同时处理多个样本，而且样本的需求量极少。基于毛细管电泳的单链构象异构多态性（CE-SSCP），结合了SSCP检测基因突变的简单快速和CE的仪器自动化，实现了快速和自动在rpoB基因、inh A-mabA基因调节区、katG基因检测单碱基突变［28-29］。
五、高分辨率熔解（high-resolution melting，HRM）
HRM是新近发展起来的SNP及突变检测工具，也是当前比较热门的基因突变检测方法。HRM是由美国犹他大学Carl Wittwer实验室与美国Idaho公司于2003年共同合作开发的一种建立在实时荧光定量PCR基础上的技术［30-31］，不同核酸分子的GC含量、GC分布不同，因此双链DNA分子在加热变性时会有自己熔解曲线的形状和位置。HRM就是根据熔解曲线的不同，根据解链温度曲线与标准曲线的对照，准确区分野生型、杂合突变、纯和突变。此法不受突变碱基位点与类型的局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨率熔解，即可完成对样品基因型的分析，闭管检测，避免了污染造成的假阳性，同时可以检测已知和未知SNP，但是不能测出具体位置和类型。HRM技术在结核病耐药领域得到了广泛的应用，利用HRM对常见抗结核药物耐药基因的检测［32-34］，并已有相关的商品化检测试剂。
六、DNA直接测序方法
DNA测序技术是分子生物学检测的金标准，是检测结核分枝杆菌基因突变最直接的方法。该技术不断发展，从最初的双脱氧核苷酸末端终止测序法发展到今天第三代测序技术，高通量测序技术日渐成熟，为快速测序检测突变提供了技术支持。
七、商品化的突变检测技术
1.GeneXpert检测系统：该系统由美国Cepheid公司研发，整合了传统PCR检测所需的3个步骤（样品制备、扩增和检测），并把它们自动化，提供样品到GeneXpert的反应盒，系统自动进行核酸提取、核酸扩增以及目标序列的检测。作为 WHO推荐的一种检测耐药基因突变的方法，结核分枝杆菌及利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测（Xpert Mtb/ RIF）采用了GeneXpert检测系统，是一种半巢式实时荧光定量PCR体外诊断技术，针对结核分枝杆菌利福平耐药基因rpoB的81 bp利福平耐药核心区检测其是否发生突变，诊断是否对利福平耐药。2010年的多中心验证评估结果表明，该检测系统检测利福平耐药的敏感度和特异度高达97.6% 和98.1%［35］。
2.结核分枝杆菌线性探针技术（line probe assay，Li-PA）：LiPA是一种基于PCR扩增的方法，根据固相反向杂交原则设计的检测方法，将靶DNA用带有生物素的引物进行PCR扩增，带生物素的PCR产物与膜固定的捕获探针杂交，再加入交联碱性磷酸酶的链霉亲和素，洗去未结合的链霉亲和素，加入底物显色，由此来检测靶DNA特定基因的碱基突变［36］。目前国际上应用最多的LiPA是德国HAIN公司的GenoType MtbDRplus耐药检测试剂盒，通过检测rpoB、KatG基因和inhA基因启动子区的突变情况确定利福平和异烟肼的耐药性，国际上很多实验室对其进行了应用评估，其特异度和敏感度均较高。
3.基因芯片技术：是指采用光导原位合成或微量点样等方法，将核酸片段有序的固化于支持物的表面，组成密集二维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交，通过特定仪器对杂交信号强度进行分析，从而判断样品中靶分子数量。目前，已经商品化DNA微陈列芯片法在国内多中心验证结果表明，该方法检测利福平和异烟肼耐药，其敏感度和特异度分别为87.56%和80.34%、97.95%和95.82%［37］。
基因突变检测技术的快速发展，可以从分子水平来探索和研究结核分枝杆菌的各种遗传本质。虽然有多种检测技术可供选择，但是各种检测技术仍然存在一定的局限性。因此，建立和选择一种快速、有效、经济的方法仍是今后一段时间内的目标。
参 考 文 献
［1］Cole ST，Brosch R，Parkhill J，et al.Dciphening the biology of M.tubeiculosis from the complete genome sequence.Nature，1998，393（6685）：537-544.
［2］Cole ST.Learning from the genome sequence of Mycobacterium tuberculosis H37Rv.FEBS Lett，1999，452（1/2）：7-10.
［3］Orita M，Suzuki Y，Sekiya T，et al.A rapid and sensitive detection of point mutations and genetic polymorphisms using polymerase chain reaction.Genomics，1989，5（4）：874-879.
［4］Telenti A，Imboden P，Marchesi F，et al.Direct，automated detection of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis by polymerase chain reaction and single-strand conformation polymorphism analysis.Antimicrob Agents Chemother，1993，37（10）：2054-2058.
［5］Tahmasebi P，Farnia P，Sheikholslami F，et al.Rapid identification of extensively and extremely drug resistant tuberculosis from multidrug resistant strains；using PCR-RFLP and PCRSSCP.Iran J Microbiol，2012，4（4）：165-170.
［6］朱敏，李锋，盛国平，等.应用PCR-SSCP技术检测痰中结核分枝杆菌katG、rpoB、embB基因突变的研究.中国防痨杂志，2007，29（6）：508-510.
［7］包洪，于庭，刘爱忠，等.PCR-SSCP方法用于痰标本中结核分支杆菌耐药基因的检测.中国实验诊断学，2007，11（1）：82-84.
［8］Fischer SG，Lerman LS.Length-independent separation of DNA restriction fragments in two-dimensional gel electrophoresis.Cell，1979，16（1）：191-200.
［9］Fischer SG，Lerman LS.Separation of random fragments of DNA according to properties of their sequences.Proc NatlAcad Sci U S A，1980，77（8）：4420-4424.
［10］Fischer SG，Lerman LS.DNA fragments differing by single base-pair substitutions are separated in denaturing gradient gels：correspondence with melting theory.Proc Natl Acad Sci U S A，1983，80（6）：1579-1583.
［11］Li J，Xin J，Zhang L，et al.Rapid detection of rpoB mutations in rifampin resistant M.tuberculosis from sputum samples by denaturing gradient gel electrophoresis.Int J Med Sci，2012，9 （2）：148-156.
［12］Scarpellini P，Braglia S，Carrera P，et al.Detection of rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis by double gradient-denaturing gradient gel electrophoresis.Antimicrob A-gents Chemother，1999，43（10）：2550-2554.
［13］Kiers A，rost AP，van Soolingen D，et al.Use of DNA fingerprinting in international source case finding during a large outbreak of tuberculosis in The Netherlands.Int J Tuberc Lung Dis，1997，1（3）：239-245.
［14］Zhao LL，Xia Q，Lin N，et al.Multiplex allele-specific PCR combined with PCR-RFLPanalysis for rapid detection of gyrA gene fluoroquinolone resistance mutations in Mycobacterium tuberculosis.J Microbiol Methods，2012，88（1）：175-178.
［15］Caws M，Tho DQ，Duy PM，et al.PCR-restriction fragment length polymorphism for rapid，low-cost identification of isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis.J Clin Microbiol，2007，45（6）：1789-1793.
［16］Nachamkin I，Kang C，Weinstein MP.Detection of resistance to isoniazid，rifampin，and streptomycin in clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis by molecular methods.Clin Infect Dis，1997，24（5）：894-900.
［17］Tyagi S，Kramer FR.Molecular beacons：probes that fluoresce upon hybridization.Nat Biotechnol，1996，14（3）：303-308.
［18］Saribas Z，Kocagöz T，Alp A，et al.Rapid detection of rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis isolates by heteroduplex analysis and determination of rifamycin cross-resistance in rifampin-resistant isolates.J Clin Microbiol，2003，41 （2）：816-818.
［19］Nam YH，Lee SH，Ahn YC，et al.Detection of rifampin resistant Mycobacterium tuberculosis complex using denaturing HPLC.Korean J Lab Med，2008，28（2）：95-102.
［20］Cooksey RC，Morlock GP，Holloway BP，et al.Temperaturemediated heteroduplex analysis performed by using denaturing high-performance liquid chromatography to identify sequence polymorphisms in Mycobacterium tuberculosis complex organisms.J Clin Microbiol，2002，40（5）：1610-1616.
［21］Yip CW，Leung KL，Wong D，et al.Denaturing HPLC for high-throughput screening of rifampicin-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates.Int J Tuberc Lung Dis，2006，10 （6）：625-630.
［22］Shi R，Otomo K，Yamada H，et al.Temperature-mediated heteroduplex analysis for the detection of drug-resistant gene mutations in clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis by denaturing HPLC，SURVEYOR nuclease.Microbes Infect，2006，8 （1）：128-135.
［23］Evans JT，Hawkey PM，Smith EG，et al.Automated highthroughput mycobacterial interspersed repetitive unit typing of Mycobacterium tuberculosis strains by a combination of PCR and nondenaturing high-performance liquid chromatography.JClin Microbiol，2004，42（9）：4175-4180.
［24］Qiu P，Shandilya H，D'Alessio JM，et al.Mutation detection using Surveyor nuclease.Biotechniques，2004，36（4）：702-707.
［25］Pilato B，De Summa S，Danza K，et al.DHPLC/SURVEYOR nuclease：a sensitive，rapid and affordable method to analyze BRCA1 and BRCA2 mutations in breast cancer families.Mol Biotechnol，2012，52（1）：8-15.
［26］Williams DL，Spring L，Gillis TP，et al.Evaluation of a polymerase chain reaction-based universal heteroduplex generator assay for direct detection of rifampin susceptibility of Mycobacterium tuberculosis from sputum specimens.Clin Infect Dis，1998，26（2）：446-450.
［27］Mayta H，Gilman RH，Arenas F，et al.Evaluation of a PCR-based universal heteroduplex generator assay as a tool for rapid detection of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis in Peru.J Clin Microbiol，2003，41（12）：5774-5777.
［28］Krothapalli S，May MK，Hestekin CN.Capillary electrophoresis-single strand conformation polymorphism for the detection of multiple mutations leading to tuberculosis drug resistance.J Microbiol Methods，2012，91（1）：147-154.
［29］Evans JT，Parveen A，Smith GE，et al.Application of denaturing HPLC to rapidly identify rifampicin-resistant Mycobacterium tuberculosis in low-and high-prevalence areas.J Antimicrob Chemother，2009，63（2）：295-301.
［30］Gundry CN，Vandersteen JG，Reed GH，et al.Amplicon melting analysis with labeled primers：a closed-tube method for differentiating homozygotes and heterozygotes.Clin Chem，2003，49（3）：396-406.
［31］Wittwer CT，Reed GH，Gundry CN，et al.High-resolution genotyping by amplicon melting analysis using LCGreen.Clin Chem，2003，49（6）：853-860.
［32］Ong DC，Yam WC，Siu GK，et al.Rapid detection of rifampicin-and isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis by highresolution melting analysis.J Clin Microbiol，2010，48（4）：1047-1054.
［33］Yadav R，Sethi S，Mewara A，et al.Rapid detection of rifampicin，isoniazid and streptomycin resistance in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates by high-resolution melting curve analysis.J Appl Microbiol，2012，113（4）：856-862.
［34］Lee AS，Ong DC，Wong JC，et al.High-resolution melting analysis for the rapid detection of fluoroquinolone and streptomycin resistance in Mycobacterium tuberculosis.PLoS One，2012，7（2）：e31934.
［35］Boehme CC，Nabeta P，Hillemann D，et al.Rapid molecular detection of tuberculosis and rifampin resistance.N Engl J Med，2010，363（11）：1005-1015.
［36］Martlila HJ，Soini H，Vyshnevskaya E，et al.Line probe assay in the rapid detection of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis directly from clinical specimens.Scand J Infect Dis，1999，31（3）：269-273.
［37］Pang Y，Xia H，Zhang Z，et al.Multicenter evaluation of genechip for detection of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis.J Clin Microbiol，2013，51（6）：1707-1713.
（收稿日期：2013-07-15）
（本文编辑：范永德）
·综 述 ·
学校结核病暴发控制策略研究进展
路希维
【摘要】结核病暴发是我国面临的严重校园公共卫生挑战之一。笔者对学校结核病疫情面临的挑战、现场流行病学调查，以及结核病暴发处置的相关问题进行了综述，重点概述了结核病潜伏感染的筛检手段与干预措施研究进展。归纳得出：肺结核患者早期发现是控制结核病暴发的基本手段；暴露关系与PPD试验相结合是评价结核潜伏感染的有效手段；预防治疗方案的短程化与全程管理是提高潜伏感染者治疗依从性的关键，等等，为制定科学的学校结核病防控技术策略提供参考。
【关键词】结核/预防和控制； 疾病暴发流行/预防和控制； 结核菌素试验； γ干扰素释放试验
【Abstract】Tuberculosis outbreak is one of serious public health challenges in schools in China.This article reviews challenges that tuberculosis control faces in school，field epidemiologic surveys and measures dealing with tuberculosis outbreaks.It summarizes particularly the research progress of screening tools and treatment of latent tuberculosis infection and concludes that early detection of pulmonary tuberculosis cases is the fundamental approach of tuberculosis outbreak control，combination of exposure with TST is an effective means to evaluate the latent tuberculosis infection，short-term chemotherapy and full administration are critical approaches to improve patient compliance.This article provides a reference for the development of scientific strategy on tuberculosis control in school.
【Keywords】Tuberculosis/prevention&control； Disease outbreaks/prevention&control； Tuberculin test； Interferon-gamma release tests
近年来，我国学校结核病疫情防控形势严峻，结核病暴发事件频有发生，干扰了正常的学习秩序，严重影响了在校师生的身体健康，创建高效的疫情处置技术策略已成为当务之急。目前，我国在学校结核病暴发的研究尚处于起步阶段，现将国内外研究进展综述如下。
一、结核病暴发的相关概念解释
（一）结核病患者聚集（tuberculosis clusters）
是特定人群、时间和空间上发生的不寻常的结核病患者聚集，患者数可超过或不超过预期［1］。患者聚集必须通过流行病学调查进一步查明原因。因此结核病聚集性发病往往作为现场流行病学调查前对疫情的暂时性描述，不能作为最终的事件描述。
（二）结核病暴发（tuberculosis outbreak）
结核病暴发是在特定时间、地点和人群出现了多例具有流行病学关联的结核病患者，使一个集团内结核病发病数量超过预期［2］。我国尚未制定结核病暴发的具体流行病学标准。美国CDC［3］认为具备以下条件之一均可称之为结核病暴发：（1）在接触者调查中发现2例或2例以上结核病患者；（2）在1年内发生2例或2例以上具有流行病学关联的患者。在确定结核病暴发之前需通过检测菌株基因类型进一步证实传播关系。
（三）结核病集团感染
结核病集团感染是指由于结核病传染源的存在，使一个集团中的接触者感染结核分枝杆菌的人数超过正常分布。该名词在国内广泛被使用，国外文献检索没有发现“结核病集团感染”这一特定称谓。实际上集团感染是结核病暴发的同义语，但由于其描述了结核病暴发的基本属性，并侧重于感染者，具有特殊的意义，仍存在继续使用的必要。结核病集团感染者与一般的潜伏感染者不同，具有以下特点：（1）具有显性传染源和固定结核分枝杆菌属性。（2）传播关系相对明确，疫情三间分布特点较为清晰。（3）接触者群体经历了新近的暴露，已经处于发病的窗口期［4］。由于感染后前2年发生结核病的概率最高，在结核病集团感染发生后的一段时间内（一般为2年）具有较高的续发率，因此集团感染的控制是结核病暴发的关键技术环节。
（四）结核病突发公共卫生事件（tuberculosis public health emergencies）
是指突然发生，造成或者可能造成社会公众健康严重损害的重大结核病疫情。卫生部2010年将一所学校在一个学期内发生10例或10例以上具有流行病学关联的结核病患者或出现死亡患者时定义为结核病突发公共卫生事件［5］。
结核病暴发、结核病集团感染和结核病突发公共卫生事件三者既有关联也有区别。结核病暴发必然产生集团感染，但集团感染未必都导致结核病暴发。但如果集团感染处理不当，将导致结核病暴发或暴发升级，结核病突发公共卫生事件提示结核病暴发处于严重的级别，反应了公共属性。因此三者互为影响，密不可分。
二、结核病暴发防控面临的挑战
（一）结核病患者的发现延迟
结核病患者的发现延迟会导致患者病情加重，并发症增多，并使接触者经受更长时间的暴露，增加了传播的风险。因此，延误诊断是控制结核病流行最重要的障碍。在中等收入国家和高收入国家，结核病患者首诊延误时间均超过15 d，发展中国家的情况更为严重［6］。据2010年全国结核病流行性病学抽样调查显示，无症状隐匿性肺结核患者呈日益增多趋势。患者中有症状就诊者仅占47%［7］，因此首诊延误已成为学校结核病防治急需解决的问题。另外，卫生系统延误诊断也不容忽视，主要包括校医院、各级综合性医疗机构、结核病定点医疗机构的确诊延迟和疫情报告延迟等。Sreeramareddy等［8］认为中国的肺结核延误（首诊延误与卫生系统延误之和）诊断时间高达25～71 d。延迟时间如果超过结核病发病的窗口期，即使立即启动患者接触者筛查工作，也无法遏制结核病暴发的发生。因此校园结核病发现策略必须以早期发现、早期干预为目的，通过完善结核病防治工作流程和网络，加强健康促进，对校医进行技术指导，以提高患者发现的效率。
（二）学校结核病暴发的环境因素
学校是典型的群体环境，人群密集、接触密切，出现传染源后，存在结核病暴发的风险。在冬季和春季，宿舍和教室的通风条件较差，出现传染源后非常容易造成集团感染。结核病暴发初期主要表现为某个宿舍、班级的患者聚集，如不及时控制，疫情可通过公共区域（如图书馆、教室、宿舍和食堂）不断扩散蔓延，导致结核病暴发的级别加重，同时还给疫情的调查和处置增加了难度。
（三）学校结核病暴发的人群特征
既往未接种卡介苗者、PPD硬结平均直径＜5 mm者、HIV感染者均为结核病易感人群；在高中发生过结核病集团感染的高校入学新生为发病的高风险人群。另外，学生营养条件差、学习负担重、休息不足也是易感结核病的因素。学生结核病防治知晓率低下导致就诊延迟，容易导致结核病暴发的产生。
三、现场流行病学调查手段评价
（一）传染源调查
1.传染源：未经治疗的活动性肺结核，特别是痰抗酸杆菌涂片阳性或空洞型肺结核具有传染性。痰涂片阴性也可以成为传染源。国外对844所中学的结核病患者进行分析，13%的患者是由于被涂片阴性的患者感染所致［9］。鉴于我国结核分枝杆菌菌株的高耐药率，建议常规开展痰结核分枝杆菌的耐药测定。在有条件的地区所有确诊患者应进行快速耐药基因检测。
2.传播链调查：随着1998年结核分枝杆菌标准菌株（H37Rv）全基因测序工作的完成，使结核病分子流行病学得到快速发展。结核分枝杆菌基因分型技术在结核病暴发的传播链调查中发挥了独特作用。聚集性患者间的结核分枝杆菌DNA指纹图谱分析显示，相同的限制性片段长度多态性模式可被认为患者之间具有流行病学关联［10］。通过对聚集性患者的结核分枝杆菌基因型测序可发现最初的传染源，同时还可溯源并确立与该集团中既往发生的结核病患者的传播关系。另外通过指纹图谱的对比，可以区别新近感染抑或久远感染和混合感染。一般来说，指纹图谱谱带相同或相似，提示为近期发生的同源暴发；谱带相似之点较少，提示可能为久远传播；谱带不同表示无传播关系。
新近分子流行病学研究提示，结核性胸膜炎的基因族群聚集性率最高，分别达到肺结核和非呼吸系统结核病的2倍和3倍。提示结核性胸膜炎为新近的再感染［11］。
（二）接触者调查
1.暴露队列评估：相对于传染源来说，密切接触与非密切接触者的结核病续发率存在明显差别［12］，对接触者进行暴露分级可以帮助我们迅速抓住重点环节，提高筛检效率。传染源接触的暴露等级应根据患者（或传染源）的居住寝室和班级进行横向和纵向调查。暴露分级方法多用于流行病学研究，但在结核病暴发控制方面具有意义。一般来说，暴露程度可分为高、中、低3个等级。寝室和班级内的密切接触者一般处于高暴露等级；中暴露等级一般为同一楼层居住或具有接触关系的其他班级同学；低暴露等级一般为既不在同一楼层居住，又不在一个教室上课的学生。为提高调查效率，应首先对中、高度暴露人群展开调查。筛检完成后，通过对比分析不同楼层和班级的感染率，以及患者检出率，可帮助发现隐性的传播链，为重新评估感染的波及范围和扩大筛检范围提供依据。一些出现二代患者的严重混合性传播疫情，常出现多疫点暴发。此时仍需按照上述原则对新疫点的感染暴露情况做出评估。
2.患者筛检：目前，胸部X线检查（CXR）是结核病暴发后进行患者筛检的常用手段。由于X线检查对微小结节、微量积液，以及隐蔽部位病变检出存在限度［13］，往往造成CXR筛查后不久，就有结核病续发患者产生［3］。螺旋CT具有较强的密度和空间分辨率，对肺结核病变内部结构、隐蔽部位、微小病变、淋巴结病变的检出明显优于X线胸片，可将临床的结核病患者从结核分枝杆菌潜伏感染者中分离出来，采取积极的治疗措施，达到减少续发患者产生的目的。Lee等［14］在 一 起 结 核 病 暴发 事 件 中，应 用 高 分 辨 率CT （HRCT）对76名胸部X线检查正常的疑似潜伏感染者进行筛检，发现9例（12%）肺内存在活动性病变。如果不进行HRCT扫描，这些患者将一直会被误认为潜伏感染者，从而使用单药预防的方案，则可能会导致耐药性产生。近年来低剂量螺旋CT扫描技术的推广，也为该技术在结核病暴发群体筛检中提供了有价值的应用前景。但国内在使用CT进行患者筛检上存在较多顾忌，主要有：对CT发现的微小病变是否按照肺结核进行疫情报告，对其选择初治标化方案还是预防性治疗方案，以及推广CT筛检所产生的放射性损伤问题等等。在尚未形成共识的情况下，为进一步提高患者检出水平，对CXR筛检阴性但有症状的接触者进行CT检查是一种折中的选择。
3.潜伏感染者的筛检：一般可采用PPD试验与γ干扰素释放分析试验两种手段。
1）PPD试验：PPD作为一种评价潜伏感染的流行病学调查手段仍具有重要价值。暴发后PPD硬结平均直径频数分布曲线显著右移，往往提示结核病集团感染的发生，这是一种较为传统的做法。但PPD硬结平均直径频数分布曲线右移无法对结核病集团感染做出量化估计，对于轻度右移的情况需结合该集团“自然年感染率递增水平”才能做出准确评估。
由于其受卡介苗接种及与其他环境分枝杆菌之间交叉免疫反应的影响，PPD试验无法将结核分枝杆菌感染从卡介菌、非结核分枝杆菌中区分出来，导致其特异度不足［15］。因此，对于个体而言，PPD试验诊断潜伏性结核病感染（LTBI）存在限制，国际上将未接种BCG者普遍采用PPD硬结平均直径≥5 mm作为阳性标准；接种BCG者以PPD硬结平均直径≥10 mm作为阳性标准。我国将PPD硬结平均直径≥15 mm作为阳性标准。PPD试验的截断值升高，虽然特异度随之升高，但敏感度下降，在事件调查中可能遗漏真正的感染者。美国胸科协会（ATS）提出，两年内PPD硬结平均直径净增≥10 mm定义为PPD阳转（TST conversion）［16］，提示为新感染。将PPD阳转作为我国现行结核病潜伏感染标准的一个补充标准值得推荐。由于需对结核病暴发作出快速反应，这里所说的PPD净增值是基于结核病暴发首次PPD硬结平均直径调查值与既往PPD硬结平均直径值对比得出的，而非结核病暴发12周后的PPD硬结平均直径的净增值。
机体感染结核分枝杆菌后，PPD的反应性时间间隔为8周（范围为2～12周），这个时期被称为“PPD反应窗口期”［3］。对于急性发生的结核病暴发事件，新发结核病患者的PPD阳性率较低，此时进行接触者PPD检测，可能会造成假阴性过多，需要在12周后重新进行PPD检测，这对于结核病暴发应急处置工作来说无疑是一个挑战。另外，PPD试验在结核性胸膜炎诊断中也存在限度，西班牙的一组254例结核性胸膜炎患者中，只有66.5%的患者PPD阳性，香港的研究PPD阴性的比例达到1/2以上［17］。
2）γ干扰素释放分析试验：γ干扰素释放分析试验（IGRA）的技术原理是用卡介菌及非结核分枝杆菌所缺失的特异性蛋白CFP-10、ESAT6等作为抗原刺激物刺激结核分枝杆菌感染者外周血单个核细胞中的结核特异性活化T细胞分泌γ干扰素，通过定量或定性检测手段判断结核分枝杆菌潜伏感染。IGRA包括两种检测方法：干扰素体外释放酶联免疫法（QuantiFERON-TB Gold，QFT-G）与结核感染T细胞斑点试验（T-SPOT）。IGRA不受卡介苗接种的影响，并且可将结核分枝杆菌感染从大多数非结核分枝杆菌感染中分离出来，因此特异度大大提高。综合文献报道，IGRA诊断活动性肺结核的敏感度为70%～80%，特异度为88%～97%［18］，与PPD试验比较特异度显著升高。美国2010年出版的IGRA检测结核分枝杆菌感染的最新指南推荐，对于卡介苗接种人群应使用IGRA进行感染调查［4］。多中心研究发现，IGRA与暴露等级相关性好，而PPD试验差强人意［19-22］。日本对一起普遍接种卡介苗的学生群体在发生结核病暴发事件后进行PPD和QFT-G联合检测，接触者中PPD试验阳性率为93.2%，非接触者为72.3%。接触者中IGRA阳性率为33%，非接触者中阳性率仅为1%，说明两个群体明显不同［22］。Arend等［22］针对一起超市发生的结核病暴发事件，联合使用了PPD试验、QFT-G和T-SPOT对接触者进行了大样本的观察和研究，结果表明IGRA与接触者的暴露水平密切相关，其中QFT-G效果更佳。路希维等［23］在一起学校结核病暴发事件中应用PPD硬结平均直径≥15 mm、PPD硬结平均直径≥10 mm和IGRA等进行联合感染检测，结果显示IGRA阳性、PPD硬结平均直径≥10 mm与暴露水平具有相关性，虽然PPD硬结平均直径≥10 mm能反映暴露水平，但由于阳性率过高，难以针对性地启动感染控制而被从指标评价体系中排除。所有这些情况都间接证明，IGRA是一种迄今为止较为理想的结核病集团感染的筛查手段。由于IGRA试剂成本较高，需要政府将其纳入学校结核病公共卫生储备才能得到推广使用。
四、结核病暴发处置的相关问题
结核病暴发处置的目标是发现和治疗所有与暴发相关的患者、及时启动接触者调查，以及对潜伏感染者进行医学评估、随访，并保证规律完成预防性治疗的疗程。
（一）患者管理
患者的诊断治疗和管理具体应参照《结核病控制规划实施指南》进行，这里不再赘述。所有确诊和疑似患者均需进行短期隔离治疗。充足的临床证据表明，发生结核病暴发后隔离的目标患者为痰结核分枝杆菌涂片阳性和（或）培养阳性的患者。一旦有效的化学治疗开始2周后，患者的传染性几乎消失［24］。卫生部《学校结核病防控工作规范》规定，对于涂阳和重症涂阴患者应在完成2个月治疗后方考虑复学，这在我国尚未普及耐药快速检测和结核分枝杆菌快速培养技术的情况下是一种较为明智的选择。对于涂阴的轻症患者，其复学的时间应以不小于2周为宜。复学时影像学检查和痰涂片检查结果为重要的参考条件，同时进行痰结核分枝杆菌分子生物学检测可有效解决痰涂片敏感度不高的问题。
（二）潜伏感染者管理
1.预防性治疗对象调整：结核病暴发后，潜伏感染者是重点干预的对象。由于PPD试验的限度，在确定预防性治疗范围时，不能机械地使用PPD试验来设定集团潜伏感染者范围，要结合与传染源的暴露等级和接触暴露时间等流行病学要素进行综合分析。其中密切接触是优先考虑的因素，研究证实密切接触者无论PPD试验结果是否阳性，发病的概率均较高，需要进行药物预防性治疗［25］。ATS在潜伏感染诊断指南中［26］指出：在高暴露人群中PPD硬结平均直径≥5 mm被认为是阳性标准；在中度暴露风险PPD硬结平均直径≥10 mm被认为是阳性标准；在没有感染风险时PPD硬结平均直径≥15 mm被认为是阳性标准，该指南较好地解决了PPD的不足，对于结核病集团感染控制具有重要意义。另外，与活动性肺结核患者有近期密切接触者，但仍处于12周的窗口期之内，PPD试验硬结反应尽管是阴性的，也需评估进展为活动性肺结核的高风险并立即进行潜伏感染治疗，在12周后应重复进行PPD试验测试，如果PPD试验结果阳转或净增值增加则治疗应持续，如果PPD试验持续阴性则终止预防［27-28］。
2.潜伏感染者预防性治疗方案：常用的预防性治疗方案包括2种：（1）单用异烟肼预防，疗程6～9个月。（2）异烟肼联合利福平预防，疗程3个月。二者的化学预防效果大致相同［29］。国外多中心研究证实：口服异烟肼0.9 g、利福喷丁0.9 g，每周用药1次，疗程3个月（共计服药12次）的预防方案，与9个月的单独异烟肼预防结核病一样有效，药物不良反应率为4.9%［30］，并有较理想的完成治疗率（82.1%）。国内刘玉清等［31］报道采用异烟肼0.6 g、利福喷丁0.6 g（体质量50 kg以上），每周2次给药，疗程为3个月（共计服药25次），完成疗程率为90%，不良反应率为3.3%，也取得了较好效果。总之，治疗方案的短程化和降低服药次数是提高治疗依从性的关键环节。在治疗前，结核病防治机构要对潜伏感染者进行用药指导，并做好定期的血常规和肝功能复查。
3.治疗的依从性与改进：潜伏感染者用药管理是结核病防治人员面临的主要挑战［32］。治疗依从性差的原因是多方面的：学生、教师和家长的认识不足，主观性抵制、对不良反应的担心、治疗的期限、经济负担、重视程度不足、缺乏有效管理手段等，均可导致接受治疗率不足和治疗完成率下降。为进一步提高依从性，需通过执行免费的预防干预政策，制定完善的不良反应监测体系，由校医、辅导员（班主任）及学生志愿者组成的结核病防治网络参与治疗管理。另外，结核病防治机构在学校有效地开展健康教育和访视可提高感染者的系统治疗率［33］。
五、学校结核病暴发的防控策略展望
在学校结核病暴发的防控工作方面，建议加大政府投入，实行免费的结核病暴发疫情干预政策，减轻患结核病学生和感染者治疗负担，提高服药的依从性；加强结核病防治机构与学校加强合作。教育部门要建立校园医疗机构建设标准，建立由校医、辅导员（班主任）和学生志愿者组成的结核病防控网络，落实好晨检和缺课登记制度，负责疑似患者追踪、疫情报告，并及时将疑似患者转诊至结核病防治机构。
在结核病暴发实施性研究方面应解决以下几个方面的问题：建立结核病暴发的Cohort队列分析，进一步明确聚集性结核病患者的产生与发展的生物学和免疫学机制；进一步论证IGRA在结核病暴发潜伏感染者评价中的价值；继续探寻可用于发病预警的新检测手段；研发超短程的药物预防方案并提高治疗依从性；尝试应用分子流行病学手段用于结核病传播关系调查等。
参 考 文 献
［1］Guidelines for investigating clusters of health events.MMWR Recomm Rep，1990，39（RR-11）：1-23.
［2］宋其生，路希维.γ-干扰素释放试验在结核集团感染控制中的应用进展.中华结核和呼吸杂志，2013，36（1）：46-49.
［3］National Tuberculosis Controllers Association，Centers for Disease Control and Prevention（CDC）.Guidelines for the investigation of contacts of persons with infectious tuberculosis. Recommendations from the National Tuberculosis Controllers Association and CDC.MMWR Recomm Rep，2005，54（RR-15）：1-47.
［4］Mazurek GH，Jereb J，Vernon A，et al.Updated guidelines for using Interferon Gamma Release Assays to detect Mycobacterium tuberculosis infection-United States，2010.MMWR Recomm Rep，2010，59（RR-5）：1-25.
［5］中华人民共和国卫生部，中华人民共和国教育部.学校结核病防控工作规范（试行）.卫办疾控发133号，2010.
［6］谭云洪，杨华林，刘松山，等.新发涂阳肺结核病人延误诊断影响因素分析.中国公共卫生，2009，25（6）：651-652.
［7］全国第五次结核病流行病学抽样调查技术指导组，全国第五次结核病流行病学抽样调查办公室.2010年全国第五次结核病流行病学抽样调查报告.中国防痨杂志，2012，34（8）：485-508.
［8］Sreeramareddy CT，Panduru KV，Menten J，et al.Time delays in diagnosis pulmonary tuberculosis：a systematic review of literature.BMC Infect Dis，2009，9：91.
［9］Tostmann A，Kik SV，Kalisvaart NA，et al.Tuberculosis transmission by patients with smear-negative pulmonary tuberculosis in a large cohort in the Netherlands.Clin Infect Dis，2008，47（9）：1135-1142.
［10］沈鑫，梅建，高谦.结核病分子流行病学研究进展.中华结核和呼吸杂志，2006，29（2）：118-120.
［11］Ong A，Creasman J，Hopewell PC，et al.A molecular epidemiological assessment of extrapulmonary tuberculosis in San Francisco.Clin Infect Dis，2004，38（1）：25-31.
［12］宋其生，陈秀琴，赵琴，等.结核菌素纯蛋白衍生物试验净增值与γ-干扰素释放试验在结核病群体感染中的诊断价值比较.中华结核和呼吸杂志，2012，35（9）：669-672.
［13］潘纪戍.成人胸部结核的CT诊断.中华放射学杂志，2000，34 （9）：583-587.
［14］Lee SW，Jang YS，Park CM，et al.The role of chest CT scanning in TB outbreak investigation.Chest，2010，137（5）：1057-1064.
［15］Menzies D.What does tuberculin reactivity after bacille Calmette-Guérin vaccination tell us？Clin Infect Dis，2000，31 Suppl 3：S71-74.
［16］Diagnostic Standards and Classification of Tuberculosis in A-dults and Children.This official statement of the American Thoracic Society and the Centers for Disease Control and Prevention was adopted by the ATS Board of Directors，July 1999.This statement was endorsed by the Council of the Infectious Disease Society of America，September 1999.Am J Respir Crit Care Med，2000，161（4 Pt 1）：1376-1395.
［17］Light RW.Update on tuberculous pleural effusion.Respirology，2010，15（3）：451-458.
［18］Lalvani A.Diagnosing tuberculosis infection in the 21st century：new tools to tackle an old enemy.Chest，2007，131（6）：1898-1906.
［19］Diel R，Loddenkemper R，Meywald-Walter K，et al.Comparative performance of tuberculin skin test，QuantiFERON-TBGold In Tube assay，and T-Spot.TB test in contact investigations for tuberculosis.Chest，2009，135（4）：1010-1018.
［20］Kipfer B，Reichmuth M，Büchler M，et al.Tuberculosis in a Swiss army training camp：contact investigation using an interferon gamma release assay.Swiss.Med Wkly，2008，138（17/ 18）：267-272.
［21］Funayama K，Tsujimoto A，Mori M，et al.Usefulness of QuantiFERON TB-2Gin contact investigation of a tuberculosis outbreak in a university.Kekkaku（Japanese），2005，80（7）：527-534.
［22］Arend SM，Thijsen SF，Leyten EM，et al.Comparison of two interferon-gamma assays and tuberculin skin test for tracing tuberculosis contacts.Am J Respir Crit Care Med，2007，175 （6）：618-627.
［23］路希维，宋其生，刘作广，等.学校结核病集团感染控制策略的初步研究.中国防痨杂志，2012，34（10）：637-641.
［24］McNicol MW，Campbell IA，Jenkins PA.Clinical features and management of tuberculosis//Brewis A，Corrin B，Geddes DM，et al.Respiratory medicine.Philadelphia：Saunders，1995：823.
［25］Morán-Mendoza O，Marion SA，Elwood K，et al.Tuberculin skin test size and risk of tuberculosis development：a large population-based study in contacts.Int J Tuberc Lung Dis，2007，11（9）：1014-1020.
［26］Targeted tuberculin testing and treatment of latent tuberculosis infection.This official statement of the American Thoracic Society was adopted by the ATS Board of Directors，July 1999. This is a Joint Statement of the American Thoracic Society （ATS）and the Centers for Disease Control and Prevention （CDC）.This statement was endorsed by the Council of the Infectious Diseases Society of America.（IDSA），September 1999，and the sections of this statement.Am J Respir Crit Care Med，2000，161（4 Pt 2）：S221-247.
［27］Menzies D，Al Jahdali H，Al Otaibi B.Recent developments in treatment of latent tuberculosis infection.Indian J Med Res，2011，133：257-266.
［28］Hauck FR，Neese BH，Panchal AS，et al.Identification and management of latent tuberculosis infection.Am Fam Physician，2009，79（10）：879-886.
［29］Ena J，Valls V.Short-course therapy with rifampin plus isoniazid，compared with standard therapy with isoniazid for latent tuberculosis infection：a meta-analysis.Clin Infect Dis，2005，40（5）：670-676.
［30］Sterling TR，Villarino ME，Borisov AS，et al.Three months of rifapentine and isoniazid for latent tuberculosis infection.N Engl J Med，2011，365（23）：2155-2166.
［31］刘玉清，屠德华，安燕生，等.大学生结核病控制的研究：（二）结核感染者的预防性治疗.中国防痨杂志，2005，27（3）：139-142.
［32］Larppanichpoonphol P，Bagdure S，Amiri HM，et al.Poor compliance makes treatment of latent tuberculosisinfection unsatisfactory.J Prim Care Community Health，2012，3（4）：246-250.
［33］Lee S，Khan OF，Seo JH，et al.Impact of Physician's Education on Adherence to Tuberculosis Treatment for Patients of Low Socioeconomic Status in Bangladesh.Chonnam Med J，2013，49（1）：27-30.
（收稿日期：2013-05-28）
（本文编辑：薛爱华）
The clinical feature and treatment of pulmonary tuberculosis complicated with cor pulmonale in 140 Uygur young adults
SHANG Yong，HE Tao，Dilala TU'ERXUN，Shajidan YASHENG，CHEN Xiao-yu. The Second Department of Respiratory，first People's Hospital of Kashi，Xinjiang，Kashi 844000，China
SHANG Yong，Email：shangyongls123@sina.com
Objective To analyze the clinical feature and treatment of pulmonary tuberculosis（PTB）complicated with cor pulmonale in Uygur young adults in order to reduce misdiagnosis.Methods The course of disease，clinical feature and treatment of 140 Uygur young adults with PTBcomplicated with cor pulmonale aged 20-55 hospitalized in the First People's Hospital of Kashi in 2010—2012 were analyzed retrospectively.Results Among the 140 cases，there were 28 cases with hemoptysis，140 with pulmonary rales，68 with emphysema sign，81 with liver enlargement and leg edema and 45 with hydrothorax and seroperitoneum.Sixty-two cases were diagnosed with cor pulmonale by EGG，60 with P pulmonale，59 presented low voltage of QRS complex in the limb leads，51 with arrhythmia.Seventy-eight cases were diagnosed with cor pulmonale by color doppler echocardiography.After treatment，121 cases'condition improved and 19 cases died.Conclusion As Uygur young adults with PTB complicated with cor pulmonale have atypical symptoms，measures should be implemented for timely detection and standardized treatment to reduce mortality.
Tuberculosis，pulmonary/complications； Pulmonary heart disease； Young adults；Uygur nationality
Discussion on clinical trial，production and quality control of in vitro Mycobacterium tuberculosis IFN-γdetection reagents
DU Wei-xin，CHEN Bao-wen，XU Miao，YANG Lei，LUJin-biao，WANG Guo-zhi. National Institutesfor Food and Drug Control，Division of Bacterial Vaccines，Beijing 100050，China
Corresponding author：WANG Guo-zhi，Email：tbtestlab@126.com
Research progress on the detection methods of Mycobacterium tuberculosis gene mutatio
n
LIU Zheng-wei*，HUANG Yu，ZHAO Yan-lin.*Department of TBControl and Prevention of Zhejiang Provincial Center for Disease Control and Prevention，Hangzhou 310051，China
Corresponding author：LIU Zheng-wei，Email：zhengweiliu@126.com
Research progress of control strategy on tuberculosis outbreak in school
LU Xi-wei. Dalian Tuberculosis Hospital，Dalian 116033，China
2013-03-13）
844000新疆喀什地区第一人民医院呼吸二科
商勇，Email：shangyongks123@sina.com
“十二五”国家重大科技专项（2012ZX10004702）
作者单位：100050北京，中国食品药品检定研究院结核病疫苗室
通信作者：王国治，Email：tbtestlab@126.com
作者单位：310051杭州，浙江省疾病预防控制中心结防所［柳正卫（中国疾病预防控制中心公共卫生硕士研究生）、黄玉］；中国疾病预防控制中心结核病预防控制中心（赵雁林）
通信作者：柳正卫，Email：zhengweiliu@126.com
作者单位：116033大连市结核病医院
