高邮鸭和金定鸭胸肌早期发育及MyoD1基因表达分析

朱春红，陶志云，宋 迟，宋卫涛，胡 艳，束婧婷，章双杰，李慧芳

（江苏省家禽科学研究所生物技术研究室，江苏扬州225125）

胚胎以及成体骨骼肌发育过程中均依赖于生肌调节因子（Myogenic regulatory factors，MRFs）家族的精准调控，MRFs家族成员包括肌分化因子MyoD1、肌细胞生成素MyoG （Myogenin）、生肌决定因子Myf5和Myf6［1－3］，调控从前体肌细胞的定型、增殖以及肌纤维的形成，直到个体出生后肌肉的成熟和功能的完善等肌肉发生发育的各个环节，且其功能与之在骨骼肌发育过程中的表达时序性关系密切［4］。MRFs家族在骨骼肌细胞的决定和分化中都是必需的，但其在肌肉发育过程中的作用不同，在肌肉发育初级阶段，MyoD1和Myf5主要在成肌前体细胞的命运决定和成肌细胞增殖中起作用［3］，而肌肉发育次级阶段中MyoG和Myf6 基因则在成肌细胞的融合和分化中起作用。目前国内外对家禽生肌调节因子MRFs家族的研究主要集中于其基因多态性与生产性状或者繁殖性状的相关性上［5－7］，而对其表达模式的研究相对较少。

本研究以高邮鸭和金定鸭为研究对象，采用qPCR 技术研究不同品种鸭胚胎期以及初生期胸肌中MyoD1基因的发育性表达变化，并分析MyoD1基因的表达变化与骨骼肌发育变化的相关性，以探索其在胸肌发育过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 试验动物

在相同日粮水平以及相似饲养条件下，收集高邮鸭和金定鸭种蛋，孵化前进行称重、消毒和编号，品种内蛋重变异系数在2%以内。2组种蛋随机置入同一孵化箱，在相同条件下（温度为37.5～37.8℃，相对湿度为50%～70%）同时孵化。种蛋入孵后24h设定为1胚龄，分别于6个时间点（13、17、21、25、27胚龄和出雏后7日龄）采集胸肌样品，称重后，置于液氮速冻，然后转入－80 ℃冰箱保存。各品种各时间点采集16个个体，公母各半。

1.2 主要试剂和仪器

TRNzol－A＋总RNA 提取试剂（DP421）、SuperReal PreMix（SYBR Green）（FP204－01）、Quant cDNA 第一链合成试剂盒（QuantScript RT Kit，KR103－04）、pGM－T 克隆试剂盒（VT302－02）、质粒小提试剂盒（TIANprep Mini Plasmid Kit，DP103－02）、DNA 产物纯化回收试剂盒（TIANquick Midi Purification Kit，DP204－02）购自TIANGEN 公司；DNA Marker DL2000 为 TakaRa 公司产品。9700PCR 仪和Mx3000P荧光定量PCR 仪（爱普拜斯应用生物系统上海有限公司）；凝胶成像系统（Tanon 2500）；紫外分光光度计（GeneQuant II，Pharmacia Biotech）。

1.3 试验方法

1.3.1 总RNA 提取和cDNA 合成 肌肉总RNA提取按TRNzol－A＋总RNA 提取试剂的说明书进行。RNA 样品经1%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测，保证RNA 样品质量可靠，计算样品总RNA 浓度。cDNA 第1链的合成按照反转录试剂盒的使用说明书进行，用持家基因GAPDH 检测cDNA 合成质量以及是否有基因组DNA 残留。

1.3.2 引物设计、目的片段的克隆 根据Gen－Bank 中鸭MyoD1 mRNA 序列（登录号为：FJ374143.1）采用Primer Premier 5.0软件在外显子区设计PCR 引物，并交由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列为MyoD1－F：5＇－AAGGCGTGCAAGAGGAAGAC－3＇，MyoD1－R：5＇－TGGTTGGGGTTGGTGGA－3＇，扩增片段长度为131bp；PCR 反应体系：PreMIX 10μL，上下游引物各0.5 μL （10 μmol／L），模板cDNA 2 μL，RNase－Free ddH2O 7μL；反应条件：95℃预变性1min；95℃30 s，55 ℃30s，72 ℃1min，35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR 产物经2%琼脂糖凝胶鉴定后，用DNA产物纯化回收试剂盒纯化回收目的片段，与pGM－T载体相连接，然后转化Eschericbia.coli TOP10感受态细胞，挑取转化子于含氨苄抗性的LB 液体培养基中，37 ℃、200r／min振摇培养过夜，用PCR 鉴定。将鉴定正确的质粒送上海生工公司进行测序。

1.3.3 荧光实时定量PCR［8］所用qPCR 采用SYBR Green I法，20μL 反应体系如下：RealMasterMix（SYBR GreenI）9μL （2.5×Real Master Mix，20× SYBRsolution），上下游引物各0.5μL（10μmol／L），cDNA 模板2μL，加ddH2O 8μL 补足20μL。反应条件：按试剂盒说明，95 ℃2 min，94 ℃20s；60 ℃20s、72 ℃20s共40 个循环，扩增后进行熔解曲线分析，温度以0.5℃／30s的速率从60 ℃递增到95 ℃。每次反应均设阴性对照，用于标准曲线的标准品和待测样品（各重复3次）。

1.4 数据统计分析

（1）标准品拷贝数计算：样本分子量＝碱基数×324；拷贝数（copies／uL）＝标准品浓度／样本分子量×6×1014。

（2）根据得到的标准曲线方程，将得到的未知样本Ct值代入线性方程即可得出未知样本拷贝数。

运用SPSS 20.0软件中One－way ANOVA 和Bivariate Correlation分析胸肌中MyoD1mRNA 表达量与胸肌重的相关性。P＜0.05表示差异显著；P＜0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 不同鸭品种发育早期胸肌组织中MyoD1mRNA 表达

鸭胚胎期和初生早期胸肌中MyoD1mRNA 的表达结果见图1。由图1可见，MyoD1mRNA 在高邮鸭和金定鸭的胸肌组织不同发育时段均有所表达，且在上述两个品种胸肌组织中表达模式相似，均呈“波浪形”，在13胚龄时表达量相对较高，17胚龄时下降，21胚龄时表达量上升，随后下降，出雏后又维持较高水平，高邮鸭27胚龄及金定鸭25胚龄时胸肌组织中的表达量极显著水平低于金定鸭13胚龄的表达量（P＜0.01）。

不同鸭品种间表达量分析比较发现，除了在25胚龄时金定鸭胸肌中MyoD1mRNA 表达量稍低于高邮鸭，在其他所检测的胚龄／日龄中，金定鸭胸肌中MyoD1mRNA 表达量均高于高邮鸭胸肌中的表达量，但表达量在品种间的差异不显著（P＞0.05）。

2.2 鸭发育早期胸肌MyoD1 mRNA 的表达与胚重、胸肌重量变化的二元变量相关性

高邮鸭和金定鸭发育早期胸肌中MyoD1mRNA 的表达与胚重、胸肌重量发育的二元变量相关性分析发现，高邮鸭胸肌中MyoD1 mRNA 的表达与胚重以及胸肌重的发育变化不相关；而金定鸭胸肌中MyoD1mRNA 的表达与胚重的发育变化表现出负相关（P＝0.048），与胸肌重发育变化呈现出负相关（P＝0.006），金定母鸭的相关水平要高于公鸭。具体结果如表1所示。

图1 高邮鸭和金定鸭胸肌中MyoD1mRNA 发育性表达变化Fig.1 Expression change of MyoD1mRNA in pectorales of Gaoyou duck and Jinding duck

表1 鸭发育早期胸肌中MyoD1mRNA 的表达与胚重、胸肌重发育变化的二元变量相关性分析Table 1 Bivariate correlation analysis of MyoD1mRNA expression and weight development changes of embryo and pectorales

3 讨论

国内有重要经济价值的两个地方鸭品种－高邮鸭和金定鸭在骨骼肌发育等相关性状上存在明显表型差异，是研究肌肉生长发育的理想动物模型［8］，因此本研究选用上述两个品种进行鸭发育早期胸肌组织中MyoD1 基因的表达差异分析。MyoD1 mRNA 在不同品种鸭胸肌的表达变化表现出一致的规律性，呈“波浪型”，在13胚龄时表达量相对较高，17胚龄时下降，21胚龄时上升到最高，随后下降，出雏后又维持较高水平。在鸭出壳后的表达量仍维持一定的表达水平，推测MyoD1 基因在胚胎形成后肌肉的发育过程中也起重要作用，一方面胚胎形成后仍有部分成肌细胞处于增殖和早期决定阶段，需要通过MyoD1基因以及Myf5基因的表达来实现这些细胞的早期命运决定；另一方面，这可能与MRFs家族各成员间的复杂作用关系有关［9］。

金定鸭胸肌中不同胚龄间的表达差异水平较高邮鸭大，金定鸭除25 胚龄外，其他胚龄／日龄中MyoD1mRNA 的表达量均高于高邮鸭。Cinar报道在6月龄皮特兰猪和杜洛克猪腰肌中MyoD1 mRNA 表达量无显著的品种差异［10］，这可能和其只检测发育过程中的一个时间点有关。另外，MyoD1基因表达量和胚重、胸肌发育变化的二元变量相关性分析发现金定鸭胸肌中MyoD1mRNA 的表达与胚重、胸肌重发育负线性相关水平分别达显著和极显著水平，而在高邮鸭中未检测出显著水平的相关，这可能与MyoD1 基因在不同品种胸肌组织中的不同水平有关。Cinar等［10］利用主成分分析方法分析MyoD1基因对6月龄皮特兰猪和杜洛克猪肌肉发育影响，结果表明MyoD1 基因的表达对上述两个猪品种腰肌肌肉生长的权重值相当，本试验结果和Cinar的研究结果存在差异，这一差异可能是由于物种（家禽／哺乳动物）差异所致。

MyoD1基因在鸭胚以及鸭初生期的发育性表达分析研究结果显示，上述基因不但在胚胎期鸭早期发育中发挥重要作用，且在鸭新生早期的发育中也发挥重要作用。本试验对MyoD1基因表达规律及表达模式的研究，为研究鸭鸭骨骼肌生长发育规律提供了理论基础，同时也为提高地方品种鸭产肉性能和提高肉品质提供新的育种信息。

［1］Davis R L，Weintraub H，Lassa A B.Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts［J］.Cell，1987，51（6）：987－1 000.

［2］Braun T，Busebhansen－Denker G，Bober E，et al.A novel human muscle faetor relate to but distinct from MyoDl induces myogenic conversion in 10TI／2fibroblasts［J］.EMBO J，1989，8（3）：701－709.

［3］Braun T，Bober E，Busebhansen－Denker G，et al.Differential expression of myogenic determination genes in muscel cells：possible autoactivation by the Myf gene products［J］.EMBO J，1989，8（12）：3 617－3 625.

［4］孙文浩，朱 庆.生肌决定因子Myf5基因研究进展［J］.黑龙江畜牧兽医，2008（7）：28－30.

［5］孙文浩，朱 庆，蒋小松，等.鸡Myf6基因遗传多态性及遗传效应研究［J］.遗传，2008，30（1）：71－76.

［6］王 琼，朱 庆，刘益平，等.MyoG 基因多态性与优质肉鸡屠宰性状和肉质性状的相关性分析［J］.遗传，2007，29（9）：1 089－1 096.

［7］寇 洁，李 亮，王继文.5个鸭品种MyoD 基因外显子1的多态性及其与屠宰性状的关联分析［J］.中国畜牧杂志，2011，47（19）：10－12.

［8］朱春红，徐文娟，胡 艳，等.高邮鸭和金定鸭发育早期骨骼肌发育及IGF－IR 基因表达分析［J］.农业生物技术学报，2013，21（2）：192－198.

［9］魏园丁.鸭MyoD1和Myfs基因cos区克隆及其在肌肉组织中发育差异性表达研究［D］.四川雅安：四川农业大学，2009.

［10］Cinar M U，Fan H T.The mRNA expression pattern of skeletal muscle regulatory factors in divergent phenotype swine breeds［J］.Kafkas Univ Vet Fak Derg，2012，18（4）：685－690.