盐度对MFC产电及其微生物群落的影响

罗 勇 ,骆海萍 ,覃邦余 ,刘广立 *,张仁铎

(1.江西省环境监测中心站,江西 南昌 330077；2.中山大学环境科学与工程学院,广东 广州 510275；3.广东省环境污染控制与修复技术重点实验室,广东 广州 510275)

在海洋食物制品行业、印染行业、石油天然气行业和饮用水处理等工业处理过程中,都会产生大量的高盐度废水(＞2%W/VNaCl)[1-2].处理高盐度废水主要有物理、化学和生物技术,其中生物方法相对廉价且可以持续利用[3-5].然而,用生物方法处理高盐度废水时,高盐度废水会影响微生物的物理和生物化学性能,导致微生物细胞脱水,从而影响生物反应器的处理性能[6-7].

近年来微生物燃料电池(MFC)在污水处理领域受到了国内外广泛的关注,尤其是其利用微生物为催化剂将废水中的有机物转化为电能的优点更是格外引人关注[8].自从2004年美国宾州州立大学Logan小组首次将单室MFC用于处理生活污水并取得较好效果之后[9],此后,各种各样的实际废水被用于MFC中.目前,MFC已被证明能够处理多种高浓度有机废水[9-11],如养猪废水、生活污水和糠醛废水等.然而,用 MFC去处理高盐度废水时,废水中的盐分很可能通过影响阳极燃料的氧化,电子传递以及微生物群落,从而影响MFC的性能.因此,研究盐度废水对MFC性能影响同时分析盐度影响MFC的过程是很有必要[12],然而,迄今鲜见相关报道.

本课题组使用运行超过3个月的双室MFC研究不同盐度对MFC产电性能的影响,同时调查MFC阳极微生物能否忍受高盐度废水以及盐度的变化是否会导致阳极微生物群落改变.

1 材料和方法

1.1 试验装置和材料

实验使用的三个MFC反应器均由有机玻璃制成,其形态和结构与之前报道的类似[8].阴极室和阳极室的体积均为 18mL,两极之间采用质子交换膜(Dupont,212)隔开.阴极采用50mmol/L铁氰化钾作为电子受体. 阳极材料和阴极材料均为碳毛刷纤维,其长宽分别为7 cm和3.6cm.外电路通过导线与插入阴阳极的碳纤维相连而构成回路,外电阻是1000Ω.阳极液和阴极液可通过恒流泵(上海琪特分析仪器有限公司,BT12200)以流速为 20mL/min分别在阴阳室和阴阳极瓶(200mL棕色瓶)之间循环流动. MFC输出电压由DT85数据采集卡每隔30S采集一次.MFC始终保持在恒温水浴锅中[(30±1)℃].

1.2 MFC的接种与运行

本研究采用的3个MFC反应器,分别标记为 MFC-A、MFC-B和 MFC-C.从已稳定运行半年的MFC中接种微生物到三个MFC阳极中.此后,加入1000mg/L葡萄糖作为阳极基质运行所有 MFC,待所有 MFC获得两个稳定的电压输出周期后.在 MFC-A阳极基质中依次加入20,40,60,70g/LNaCl,在每个盐度下运行至少 2个周期;在MFC-B中.在阳极基质中加入40g/L NaCl,在此盐度运行至少2个周期;在MFC-C中,在阳极基质中直接加入 70g/L NaCl,同样运行至少2个周期.

1.3 MFC阳极微生物的群落分析

MFC阳极微生物的群落分析过程如下,首先,使用FastDNA SPIN for Kit (MP BIO, IIIKirch,France)提取阳极电极上细菌的 DNA,并将提取后的 DNA 样品放置在-20℃冰箱中保存.使用V3-2 (5-ATTACCGCGGCTGCTGG-3)和V3-3(5-CGCCCGCCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3)(Invitrogen Biotechnology Co., Ltd.)两种引物从已提取的 DNA上去扩增 16S ribosomal DNA(rDNA). PCR的扩增液主要包括：17.37L dd H2O,2.5L 10´PCR Buffer,2.0L DNTP mixture,0.5L V3-2,0.5L V3-3,0.13L Taq polymerase和2L样品.

PCR产物的DGGE分析在变形梯度凝胶电泳中进行,电泳液为20L左右的1×TAE,温度设定为60℃.将点有PCR产物样品的聚丙烯酰胺凝胶放入电泳槽内,在200mV电压下电泳 6h.电泳结束后,将胶在浓度为 5μL EB/100mL 1×TAE的溶液避光染色20min,然后在紫外成像系统中拍照.

用手术刀把目的条带从DGGE胶上切割下来,加入 20μL TE溶液,捣碎胶块,在温度为 50℃的水槽中,水浴 30min,然后以转速为 12000r/min离心30s.取上清液5μL,用V3-1和V3-2为引物在25μL混合体系中进行PCR扩增. PCR产物送Invitrogen公司进行测序.测序结果与 NCBI用BLAST进行比对.

1.4 分析和计算方法

CODcr为标准分析方法[11].库仑效率CE的计算如下[8]：

式中：M为氧气的分子量,32g/mol;ti为时间;Ui为t时刻的电压;b为每摩尔氧气转移的电子数;V为反应器容积;R为外电阻;F为法拉第常数96487C/mol;△S为COD的变化.

体积功率密度(PV, W/m3)计算如下：

2 结果

2.1 盐度对MFC产电的限制

图 1A为 MFC-A在不同盐度下(0,20,40,60,70g/L NaCl)的11个产电周期.当阳极基质不含NaCl时,MFC的电压迅速升高到 660mV,这表明在没有NaCl的情况,阳极微生物能够很快适应葡萄糖并对外输出电能;当在阳极基质中加入20g/L NaCl后,最大输出电压轻微下降,从 660mV 下降到615mV;然而,当NaCl浓度从40g/L继续升高,最大输出电压迅速下降,至70g/L NaCl时,最大输出电压仅有130mV(图1A).在MFC-B中,当向阳极基质中直接加入40g/L NaCl后第一个周期,最大输出电压下降到 520mV,第二周期下降到300mV,此后,MFC没有明显的电能输出(图1B).在MFC-C中,当直接向阳极基质加入70g/L NaCl后第一个周期,最大电压立刻下降到 260mV,此后,MFC没有明显的电能输出(图 1C).研究表明,NaCl可以明显地限制MFC的产电,尤其是直接向阳极基质加入40,70g/L NaCl时.

图1 分别加入不同浓度NaCl时,MFC的产电情况Fig.1 Electricity voltage outputs of the MFC with the different salinity of NaCl

2.2 不同盐度下MFC的功率密度和库仑效率

图 2为阳极基质中 NaCl浓度为 0,40,70g/L时MFC-A的功率密度曲线.阳极基质的NaCl浓度为 0时,MFC的最大功率密度为34W/m3;当NaCl浓度为40g/L时,MFC的最大功率密度为 25W/m3;当 NaCl浓度提高到70g/L时,MFC 的最大功率密度为仅为1.4W/m3.NaCl的浓度也很明显地影响 CE.从表1可知,NaCl的浓度为0时,MFC的CE高达 67%;当 NaCl的浓度从 0提高到 70g/L时,CE从67%下降到4%.

2.3 盐度抑制后的MFC电能恢复

当阳极基质的 NaCl浓度为 70g/L时,MFC-A 无明显的电能输出.此时,停止添加NaCl以观察MFC电能输出是否会恢复.从图3可以看出,停止添加NaCl后的第一个周期,MFC的输出电压可以在50h内缓慢地恢复到400mV,随后下降到 50mV.更换新的基质后,输出电压能够在 10h内迅速地升高到 630mV.结果表明,MFC产电性能即使受到高盐度限制后也可以迅速地恢复.

图2 阳极基质中NaCl浓度为0,40,70g/L时MFC-A的功率密度曲线Fig.2 Power density and cell voltage as a function of current density for the MFC-A with the salinity of 0, 40, and 70g/L NaCl

表1 MFC-A中CE与NaCl浓度的关系Table 1 The CEs as functions of the concentrations of NaCl in the MFC-A

2.4 盐度变化下的阳极微生物情况分析

图4是MFC-A在0g/L NaCl (A),40g/L NaCl(B),70g/L NaCl (C)以及再次不添加NaCl(D)时生物膜中主要细菌种类基因片段成像.图 4中每条亮带代表一个细菌种类,其亮度表示该细菌在微生物群落中的相对丰富度.当 NaCl浓度为 0(A)和 40g/L(B)时,Band 1和 Band 4明显;然而,当NaCl浓度为70g/L时(C), Band 1和Band 4消失.此后,不再添加NaCl(D),Band 4再次出现且较亮度较高,但Band 1未出现,出现了Band 3,当NaCl为70g/L时,此亮带消失.几乎所有盐度下都存在Band 2,但70g/L时亮度最大.

图3 MFC-A的电能输出被70g/L NaCl限制后的恢复情况Fig.3 Electricity recovery process after the MFC-A was inhibited by 70g/L NaCl.

图4 NaCl浓度分别为0 (A),40 (B),70 (C),0g/L (D)时MFC-A的阳极DGGE图像Fig.4 PCR-DGGE analysis of 16S rDNA extracted from the anode of the MFC-A with a salinity of 0 (A), 40 (B),70 (C), and 0g/L NaCl (D)

对亮带进行 DNA序列测定后将结果与Blast进行比对,结果见表2.Band 1与Uncultured Bacteroidetes bacterium clone A21YG08RM small subunit具有 96%的同源性;Band 2与 Uncultured soil bacterium clone F3-266 16S ribosomal RNA gene 具有97%的同源性;Band 3和Band 4分别与16S rDNA sequence homology with Enterobacter cloacae subsp. dissolvens strain SDM 16S ribosomal RNA gene, partial sequence 和 Shewanella sp. JC19 partial 16S rRNA gene, strain JC19展示了100%的同源性.这4个DNA条带的序列在Gene bank的登录号分别从HQ657324到HQ657327.

表2 不同盐度下MFC-A生物膜上细菌16S rDNA 基因片段特性Table 2 Characterization of isolated 16S rRNA gene fragments derived from the electrodes of the MFC-A with different salinities

3 讨论

在以往的研究中,关于 NaCl浓度对废水生物反应器性能的影响存在一些争议.有学者认为,在生物反应器加入少量的NaCl可以提高微生物的活性,但当 NaCl 的浓度超过了微生物的承受能力则会导致生物反应器性能下降[13-14].另有一些研究表明,高浓度的 NaCl 会限制生物反应器对有机物的去除[15-16],如 Windey 等[17]发现当NaCl的浓度达到30g/L时,生物反应器中微生物的活性下降 59%.在本研究中,不同的 NaCl浓度导致不同的结果,不同的 NaCl 浓度的添加方式也会导致不同的结果.如果直接将40g/L和70g/L NaCl加入到阳极液中,MFC运行几个周期后就没有电能输出;但当NaCl浓度从20g/L逐步提高70g/L NaCl 后,MFC 依然有电能输出.这一点从图1A可知,加入 20g/L NaCl,最大输出电压下降10%,加入 40g/L NaCl,最大输出电压又下降了10%,即使在70g/L NaCl的情况下,MFC依然可以对外输出电能.因此,逐步提升 NaCl浓度可以使MFC 更容易适应高盐度,今后,培养和驯化耐盐细菌将非常有利于MFC去除高盐度废水.

除了限制电能输出,高盐度同样会影响MFC阳极微生物的群落及其多样性.基于DGGE图片(图4)可知,当盐度从0提高到40g/L时,阳极微生物群落结构变化并不明显;但当盐度继续提高到70g/L 时,群落结构发生了明显的变化,一些细菌如Enterobactersp. (Band 3)和Shewanella sp.(Band 4)很可能由于不能适应高盐度而消失了.Wu 等[16]也认为盐度很明显地影响生物反应器的微生物群落结构,但 Lefebvre 等[18]却发现NaCl浓度即使提高到120g/L,微生物群落结构也没有明显地变化. 两位学者研究结果的差别可能是由于后者的生物反应器经过长期运行后,很多菌种已经适应了高盐度的环境.

有报道表明,NaCl浓度大于 1%就很可能使微生物细胞脱水,从而限制其活性[19-20].但这种限制很可能是暂时的,在本研究中,高盐度可以明显地限制 MFC 阳极微生物的活性,但盐度一旦解除了,MFC 的产电能力可以迅速恢复.这说明高盐度仅仅是暂时限制了微生物的活性.

微生物脱盐电池(MDC),由于其能够去除有机物污染物、去除废水的盐度同时对外输出电能[22],从而引起了国内外广泛的关注.然而,MDC在脱盐的过程中,越来越多的盐离子进入阳极会导致阳极的盐度迅速提升,盐度的升高很可能会影响 MDC脱盐和产电的性能.这些研究结果可以为研究高盐度下MDC的性能提供一些依据.

4 结论

4.1 当向 MFC中依次添加 0,20,40,60,70g/L NaCl, MFC的最大输出电压从 660mV下降到130mV,同时库仑效率也从 67%下降到 4%.这表明逐步添加 NaCl,即使盐度高达 70g/L NaCl,MFC仍有电能输出.

4.2 向 MFC(MFC-B 和 MFC-C)中直接添加40g/L和70g/L NaCl并运行两个周期后,MFC无电能输出,然而,停止添加 NaCl(盐度解除)后MFC产电性能能够迅速恢复.

4.3 当盐度高于 40g/L NaCl时,阳极微生物群落发生明显变化,一些不适应高盐度的群种的优势度下降,取而代之的是一些能够适应高盐度的菌种.

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