P21 和Cyclin E在胃腺癌组织中表达及相关性研究*

王亚东 杨留才 徐红涛 李仕红

(1.阜宁县人民医院， 江苏 阜宁 224400；2.盐城卫生职业技术学院， 江苏 盐城 224005)

胃癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，我国胃癌的发病率占恶性肿瘤的发病率的第二位，死亡率占恶性肿瘤的第三位[1]。目前的研究认为我国胃癌的发生可能和癌前病变、饮食习惯、吸烟、酗酒、幽门螺杆菌感染和家族史有关[2]。早期胃癌症状隐匿，患者出现自觉症状时往往已是中晚期，丧失了早期治疗、提高生存率的机会。研究表明，P21 和Cyclin E在多种恶性肿瘤中的表达均较正常组织发生了明显的改变，而上述两种细胞因子均和细胞周期的调控有关[3，4]。本次研究通过检测P21和Cyclin E在胃癌组织中阳性表达率，并且研究两者的阳性表达之间是否存在相关性，从而试图为胃癌的诊断和治疗提供一种新的思路。

1 资料和方法

1.1病例资料收集自2009年1月至2011年12月3年间在我院普外科就诊并且手术治疗，并且经过病理诊断确诊为胃腺癌的蜡块标本98例作为试验组，其中男性患者63例，女性患者35例，平均年龄(46.57±17.68)岁；按照年龄进行分类，按照国际抗癌联盟(Union for International Cancer Control, UICC)临床分期标准对胃腺癌患者进行分期，Ⅰ期17例，Ⅱ期23例，III期36例，IV期22例；病理诊断为高分化31例，中分化42例，低分化癌25例；术后病理诊断确认有淋巴结转移68例，无淋巴结转移30例，胃腺癌患者在进行手术之前均没有经过化疗等治疗措施。采集病理标本均采用4%多聚甲醛进行固定，常规石蜡包埋切片，切片厚度为5 μm。另外取病理诊断为正常胃黏膜的蜡块标本34例作为对照组，标本来自于胃溃疡切除术或者十二指肠切除术的患者，均通过病理诊断排除了高度不典型增生，其中男性患者20例，女性患者14例，平均年龄(47.23±18.49)岁。胃癌组和对照组的年龄、性别均无统计学意义。

1.2实验方法 切片厚度为5μm，脱蜡水化后微波修复5min，3%过氧化氢孵育10min去除内源性过氧化物酶， 加兔抗人Cyclin E一抗( 1∶200, 德国Merck公司) ，兔抗人P21一抗(1∶400, 德国Merck公司)，室温过夜，PBS清洗，加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗( 1：100，美国Santa Cruz公司)室温孵育40 min；PBS清洗，加Elite-AP(英国Vector公司)孵育15min，PBS清洗，DAB底物液(中国迈新公司)显色3min，苏木素复染30sec，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察。

1.3染色结果判断 染色结果显示Cyclin E和P21均定位于胞核中，以细胞核出现棕黄色染色作为阳性。在高倍镜(×400)下选取阳性细胞最多的5个视野，每个视野计数200个细胞，根据阳性细胞在全部组织细胞中所占比例判定实验结果，阳性细胞数占全部组织细胞数比例<5%判断为(-)，阳性细胞数占全部组织细胞数比例为5%～49%之间判断为(+)，阳性细胞数占全部组织细胞比例阳性细胞数≥50%判断为(++)，以(+)及(++)以上判断为阳性。

1.4统计学方法 所有的数据使用SPSS13.0统计学软件进行分析，各组样本之间的比较采用χ2检验进行统计分析，Cyclin E和P21之间的相关关系采用Spearman等级相关检验进行统计分析，以P≤0.05作为有统计学意义。

2 结 果

2.1Cyclin E和P21在不同组织中的阳性表达情况 Cyclin E和P21在对照组和胃腺癌组中的表达情况见表1。Cyclin E在胃腺癌组中的阳性表达率明显高于对照组，差异具有统计学意义(χ2=50.80，P<0.05)P21在对照组中阳性表达率高于胃腺癌组，并且差异具有统计学意义(χ2=38.03，P<0.05)。

表1 Cyclin E和P21在不同胃组织中阳性表达率

2.2Cyclin E和P21在胃癌组织中表达以及与临床、病理指标关系 Cyclin E和P21在胃癌组织阳性表达情况与性别、临床分期、病理分级和淋巴结转移等临床、病例指标的关系见表2。

表2 Cyclin E和P21在胃癌组织中表达以及与临床病理指标关系

2.3Cyclin E和P21在胃癌组织表达的相关性 使用Spearman等级相关检验分析二者之间的相关关系，结果为r=-0.51，P<0.05，提示Cyclin E和P21在胃癌组织组织表达存在负相关。

表3 Cyclin E和P21在胃癌组织表达的相关性

3 讨 论

本次研究通过免疫组化的方法来研究Cyclin E和P21在胃癌组织和正常胃黏膜组织中的表达情况，结果显示Cyclin E在正常胃黏膜组织中的阳性表达率明显的低于胃癌组织，而P21在上述两种组织中的阳性表达率正好相反，并且两者之间的差异均具有统计学意义(P<0.05)；通过进一步分析Cyclin E和P21在胃癌阳性表达情况与性别、临床分期、病理分级和淋巴结转移等指标的关系，结果发现Cyclin E在胃癌中阳性表达率和性别无关，但是上述两种细胞因子和临床分期、病理分化程度、淋巴结是否有转移有关，并且差异均具有统计学意义(P<0.05)。Cyclin E 是一种重要的细胞周期调节蛋白，能够有效的促进细胞周期，是一种正性的细胞周期调节因子[5]。目前的研究表明Cyclin E在G1 期能够和细胞周期调节素依赖性激酶2(Cyclin dependence kinase 2; CDK2)结合，并且使CDK2活化，活化的CDK2能够使得视网膜母细胞瘤蛋白(Retinoblastoma; Rb)磷酸化，磷酸化的Rb蛋白能够活化转录因子E2F，促进DNA合成，促使细胞由G1 期进入S 期，从而加速细胞增殖[6，7]。而P21 是一种细胞周期负性调节因子，也是一种抑癌基因，在正常细胞周期中， P21 的功能是抑制CDK2、CDK4和CDK6等细胞周期调节素依赖性激酶被磷酸化，从而抑制Cyclin E/CDK2、Cyclin E/CDK4等复合物的活性，从而使得Rb不能磷酸化，进而使得E2F不能被活化，阻止细胞进入S 期，从而阻断细胞周期[8，9]。我们的研究表明，P21在正常胃黏膜组织中的阳性表达率明显的高于胃癌组织，并且在临床分期晚、低分化和有淋巴转移的组织中的阳性表达率明显的低于临床分期早、高分化没有淋巴转移的组织，并且差异均具有统计学意义(P<0.05)。现有的研究表明，P21表达水平下降或者P21基因发生突变，即由野生型P21变为突变型P21，都能够导致对Cyclin E/CDK2、Cyclin E/CDK4等复合物抑制减少，进而导致细胞周期过快运行，细胞增殖明显增加，进而导致肿瘤的发生[10]。

本研究还显示Cyclin E与P21在胃癌中的表达呈负相关，提示P21可能通过影响Cyclin E的表达水平来调控细胞的凋亡，其主要的作用机制在于P21能够通过直接抑制Cyclin E/CDK2复合物的活性，推迟细胞从G1期进入S期。而P21表达水平下调则会减少Cyclin E/CDK2复合物的抑制作用，从而刺激细胞增殖，导致肿瘤的发生[11]。

我们的研究结果表明，Cyclin E在胃癌的组织中阳性表达率高，并且其表达水平和临床分期、病理分级以及淋巴结转移相关；P21在胃癌的组织中阳性表达低，并且其表达水平和临床分期、病理分级以及淋巴结转移相关；Cyclin E和P21在胃癌的组织负相关，提示Cyclin E和P21胃癌的发生起到了协同作用。

[1] 刘琳娜, 张静, 丁士刚, 等. 胃癌高、低发区胃癌与慢性胃炎患者幽门螺杆菌差异蛋白质的比较[J]. 北京大学学报(医学版),2011,43(6):827-832.

[2] LIU Lin-na,ZHANG Jing,DING Shi-gang,et al. A comparison of proteomic analysis of Helicobacter prlori in patients with gastritis and gastric cancer between areas of high and low incidence of gastric cancer[J]. Journal of Peking University(Health Sciences) , 2011,43(6):827-832.

[3] 范东风. 胃癌的癌前期病变与胃癌的早期诊断及治疗[J]. 当代医学, 2011,17(12):102-103.

[4] Fan Dong-feng. Early diagnosis and treatment of precancerous lesions of gastric cancer and gastric cancer[J]. CONTEMPORARY MEDICINE, 2011,17(12):102-103.

[5] Pillay K, McCleod H, Chetty R, et al. A study to investigate the role of p27 and cyclin E immunoexpression as a prognostic factor in early breast carcinom[J]. World J Surg Oncol, 2011,9:31.

[6] Akli S, Zhang XQ, Bondaruk J, et al. Low molecular weight cyclin E is associated with p27-resistant, high-grade, high-stage and invasive bladder cancer[J]. Cell Cycle, 2012,11(7):1468-76.

[7] Shi Y, Tao Y, Jiang Y, et al. Nuclear epidermal growth factor receptor interacts with transcriptional intermediary factor 2 to activate cyclin D1 gene expression triggered by the oncoprotein latent membrane protein 1[J]. Carcinogenesis, 2012,33(8):1468-78.

[8] Yang W, Xia Y, Hawke D, et al. PKM2 phosphorylates histone H3 and promotes gene transcription and tumorigenesis[J]. Cell, 2012,150(4):685-96.

[9] Verlinden L, Verstuyf A, Convents R, et al. Action of 1,25(OH)2D3 on the cell cycle genes, cyclin D1, p21 and p27 in MCF-7 cells[J]. Mol Cell Endocrinol, 1998,142(1-2):57-65.

[10] Shamanna RA, Hoque M, Pe'ery T, et al. Induction of p53, p21 and apoptosis by silencing the NF90/NF45 complex in human papilloma virus-transformed cervical carcinoma cells[J].LID-10.1038/onc.2012.533 [doi]. Oncogene, 2012.

[11] Rosendahl AH, Sun C, Wu D, et al. Polysaccharide-K (PSK) increases p21(WAF/Cip1) and promotes apoptosis in pancreatic cancer cells[J]. Pancreatology, 2012,12(6):467-74.

[12] Suzuki A, Kariya M, Matsumura N, et al. Expression of p53 and p21(WAF-1), apoptosis, and proliferation of smooth muscle cells in normal myometrium during the menstrual cycle: implication of DNA damage and repair for leiomyoma development[J]. Med Mol Morphol, 2012,45(4):214-21.

[13] Wang N, Wang S, Zhang Q, et al. Association of p21 SNPs and risk of cervical cancer among Chinese women[J]. BMC Cancer, 2012,12:589.