色素上皮衍生因子在DM时肾脏病变中的作用及意义

苏哲君，马 莉，陈志宏

(1.承德医学院附属医院，河北承德 067000;2.承德医学院)

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)常见的严重微血管并发症，是导致慢性肾功能不全的重要原因之一[1]。目前，DN的发病机制尚未完全明了，有研究认为，高血糖或血脂代谢紊乱作为启动因素，诱导各种血管活性物质、生长因子、细胞介质和蛋白质等，多种因素综合作用导致了DN的发生、发展，最终由于细胞外基质(extracellular matrix，ECM)过度积聚引发肾小球硬化和肾间质纤维化，治疗十分困难[2]。因此，深入探讨DN的发生机制具有十分重要的意义。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组 清洁级雄性SD大鼠24只(河北医科大学实验动物学部，合格证号:712024)，随机分为正常对照组和糖尿病模型组，每组12只。正常对照组:大鼠常规饲养，不做任何处理;糖尿病模型组:小剂量(25mg/kg)链脲佐菌素(2%)连续腹腔注射(3d)建立糖尿病大鼠模型，7d后以空腹血糖≥16.7mmol/L作为成模标准[3]，待模型成功建立后，大鼠不再做任何处理。

1.2 检测血糖 各组大鼠禁食12h后，4%水合氯醛腹腔注射麻醉，经内眦于眶后静脉丛采血，3000r/min离心20min，收集血清，采用葡萄糖氧化酶法检测各组大鼠的血糖。

1.3 检测肾脏色素上皮衍生因子的表达 大鼠取血后断头处死，取肾脏入液氮保存。采用Western Blotting法检测肾脏色素上皮衍生因子(pigment epthelium-derivedfactor，PEDF)蛋白的表达:取200mg肾脏，提取蛋白后用BCA蛋白定量试剂盒(北京泰格美科技有限公司)定量蛋白浓度，蛋白上样量60μg;12% SDS-PAGE凝胶电泳、转膜，兔抗PEDF抗体(武汉博士德生物技术有限公司)稀释浓度1:200，4℃孵育过夜;Super ECL Plus超敏发光液显影。采用Quantiy One软件对显影条带进行定量分析，以PEDF条带与β-actin条带的比值作为PEDF蛋白的相对表达水平。

1.4 统计分析 采用SPSS 15.0软件行t检验。

2 结果

2.1 各组大鼠的血糖 与正常对照组比较，糖尿病模型组大鼠的血糖明显升高(P＜0.01)。见附表。

2.2 各组大鼠肾脏PEDF的表达 在蛋白Marker的50KD水平处，可见PEDF蛋白条带;在蛋白Marker的43KD水平处，可见β-actin条带。与正常对照组大鼠比较，糖尿病模型组大鼠肾脏PEDF蛋白的表达明显降低(P＜0.01)。见附表。

附表 各组大鼠血糖和肾脏PEDF的表达(±s)

附表 各组大鼠血糖和肾脏PEDF的表达(±s)

组别 n 血糖(mmol/L)肾脏PEDF的表达正常对照组 12 10.83±2.03 0.401±0.050糖尿病模型组 12 29.45±4.82* 0.339±0.014 P ＜0.01 ＜0.01

3 讨论

PEDF是丝氨酸蛋白酶抑制剂基因家族成员，在全身许多组织器官都有表达，在肾脏主要分布于肾小管上皮细胞和间质[4]。PEDF可通过抑制血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)诱导的血管内皮细胞的增殖与迁移，降低肾小球毛细血管的通透性，从而减轻蛋白尿。目前，PEDF抑制新生血管生成的机制尚不十分明确[5-6]。有研究发现，随PEDF剂量的增加，培养液中凋亡内皮细胞的数量逐渐增加，因此推测，PEDF可能具有促进内皮细胞凋亡的作用。另外，研究发现，PEDF还有可能使血管内皮细胞对缺血、缺氧诱发的新生血管形成的信号无反应，从而进一步抑制新生血管形成[7]。本研究发现，DM模型大鼠肾脏PEDF蛋白的表达明显低于正常对照组大鼠。一方面，PEDF表达水平降低，对VEGF的抑制作用减弱，使肾小球毛细血管的通透性增加;另一方面，PEDF水平降低使其促进内皮细胞凋亡的作用减弱，因而促进肾脏新生血管形成。因此，本研究推测，DM时肾脏PEDF表达下降，是DN发生发展的重要参与因素。

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