西藏地区藏鸡大肠杆菌超广谱β-内酰胺酶检测及药物敏感性分析

刘保光，世洪勋，格桑顿旦，彭措曲珍，尼夏罗布，顿 珠

（1.西藏职业技术学院 畜牧兽医系，西藏 拉萨850030；2.河南农业大学 牧医工程学院，河南 郑州450002）

鸡大肠杆菌病是指由致病性大肠埃希菌（Esherichia coli）引起的急性或慢性的细菌性传染病［1］。随着养鸡业的迅速发展和高度集约化发展，鸡大肠杆菌病已成为鸡细菌性疾病的常见多发病。据相关资料显示［2］，鸡大肠杆菌病的发病率占鸡细菌性疾病的33%，且药物的疗效明显降低。另外，由于鸡大肠杆菌的血清型众多，致使致病性和耐药性较复杂，兽医临床常用的抗菌药物对鸡大肠杆菌病的防治效果不佳，甚至无效［3］。

产超广谱β-内酰胺酶（Extended Spectrumβlactamases，ESBLs）是细菌对β-内酰胺类抗生素耐药最重要的机制［4］。近年来，由于抗菌药物在兽医临床上的广泛应用，细菌产生了能够水解此类抗生素的ESBLs，这种酶对药物有水解作用，使其失去了抗菌活性，占多数的敏感菌株不断被杀灭，耐药菌株代替了敏感菌株，致使细菌对药物的耐药率不断升高［5］。据研究资料显示［6］，产酶菌株不仅对青霉素类、头孢菌素类药物表现出耐药性，而且对多种抗菌药都表现出较高的交叉耐药性和多重耐药性。在兽医临床实践中，对分离的鸡致病性大肠杆菌的耐药情况进行及时有效的监测，不仅有利于选择合适的药物有效防治疾病，而且有助于防止耐药菌在不同菌株间散播。

本试验旨在通过ESBLs检测及药物敏感性试验，及时掌握西藏地区藏鸡大肠杆菌产ESBLs情况和耐药现状，为兽医临床合理选择抗菌药物、防止耐药菌株的传播提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株来源 从西藏地区某4个养殖场采集的症状明显的病死鸡组织，分离出4株藏鸡大肠杆菌，分别标记为（L1，L2，Z1，S2）。

1.1.2 培养基 MH肉汤（青岛高科园海博生物有限公司），GN增菌液（北京奥博星生物技术有限责任公司），MH（A）培养基（郑州博赛生物技术股份有限公司），麦康凯培养基（杭州天和微生物技术有限公司），均在有效期内。

1.1.3 药敏纸片及药品 头孢他啶CAZ（30μg／片）、头孢他啶／棒酸（CAZ／CA，30μg／片）、头孢噻肟CTX（30μg／片）、头孢噻肟／棒酸（CTX／CA，30 μg／片）、氨曲南AZT（30μg／片）、头孢曲松CRO（30 μg／片），由北京天坛药物生物技术开发公司提供。氨苄西林、阿莫西林、环丙沙星、氟苯尼考、阿米卡星、新霉素、头孢噻肟和头孢噻呋等为国产原料药。

1.1.4 仪 器 手提式压力蒸汽消毒器（上海医用核子仪器厂），隔水式电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂）、90-1磁力搅拌器（上海亚荣生化仪器厂）、电子分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）、医用净化工作台 （苏州净化设备公司），微波炉（佛山市顺德区格兰仕微波炉电器有限公司），可调式微量移液器（上海求精生化仪器有限），气浴恒温振荡器（江苏金坛市医疗仪器厂），DZF-6050型真空干燥箱（上海一恒科技有限公司）及绿色静音冰箱（新飞电器集团）等。

1.2 方 法

1.2.1 培养基的制备 按照培养基的说明书进行配制

1.2.2 产超广谱β-内酰胺酶的检测 根据2008年美国临床实验室标准化协会（CLSI，2008b）颁布的标准［7］，进行初步筛选和表型确证试验。首先，将新增菌培养的受试菌株均匀涂布于MH琼脂平板后，用无菌镊子将各种抗菌药物CRO、CAZ、CTX及AZT药敏纸片，分别贴于培养基表面，各纸片距离药相等。30 min后，将贴好纸片的平皿倒置于37℃恒温箱，培养16h后，测量各药敏纸片的抑菌圈直径，以mm计算。如任一药物对受试菌的抑菌环直径满足以下条件即为疑似产ESBLs菌株：头孢曲松（CRO）≤25 mm，头孢他啶（CAZ）≤22 mm，头孢噻肟（CTX）≤27 mm，氨曲南（AZT）≤27 mm。接着，将疑似产酶菌株做确认试验，新培养受试菌用无菌棉签涂布于MH平板，分别两两对应贴上头孢他啶CAZ（30μg／片）、头孢他啶／棒酸（CAZ／CA，30／10 μg／片）和头孢噻肟CTX（30μg／片）、头孢噻肟／棒酸（CTX／CA，30／10μg／片）纸片，37℃过夜培养后，当两组药物中有任意一组中有加CA的抑菌圈直径比不加CA的抑菌圈直径相差≥5 mm，即确定为产ESBLs菌株。

1.2.3 药物敏感性试验 根据2008年CLSI（CLSI，2008a）颁布的标准［8］，采用微量肉汤稀释法，向V型板上第一孔自上而下依次加入各种药物15μL，吸取1μL菌液于平皿中用蒸馏水按1∶1000稀释，用微量移液器吸取平皿中稀释好的菌液135μL加入第一孔中，第一孔混合均匀后吸出75 μL加入第二孔中，用同法依次二倍稀释至第12孔，弃去75μL，则各管的浓度依次为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125和0.00625μg／m L，置于37℃培养16 h，以无细菌生长孔内所含抗菌药物的最低浓度为最低抑菌浓度（MIC）。每个样品做3个重复，求其平均值。

2 结果与分析

2.1 产ESBLs的初步筛选及确证试验结果

在初步筛选试验中，有L1、L2、Z1、S2共4株菌的药敏纸片直径满足CTX≤27 mm、CRO≤25 mm或AZT≤27 mm、CAZ≤22 mm，故该4株菌初步判为产ESBLs疑似菌株。进一步确证试验中，4株疑似菌中有1株（L1）药敏试验结果显示加酶抑制剂与不加酶抑制剂的抑菌圈直径相差≥5 mm，L1菌株被确认为产ESBLs菌株。

2.2 药物敏感性试验测定结果

8种抗菌药物对4株鸡大肠杆菌的MIC值测定结果见表1。由表1结果可见，产酶菌L1对青霉素类药物、氟喹诺酮类药物、氨基糖苷类药物等多种药物耐药，仅对头孢噻呋敏感，其敏感性低于其它非产酶菌株，这说明产酶菌对抗菌药物的耐药性非常严重。菌株L2仅对阿米卡星、头孢噻呋敏感，这可能是菌株L2来自拉萨某鸡场长期使用抗菌药物造成的结果。产酶菌株L1和非产酶菌株L2对大多数抗菌药物的敏感性相似。菌株Z1和S2相对L2来说，其敏感性较高。以上结果显示，产酶菌L1对大多种类的药物的敏感性也要比不产酶菌敏感性低，说明产酶菌对这些药物的作用有一定影响，说明产酶菌株不仅对β-内酰胺类药物有耐药性，而且对其他抗菌药物，如氨基糖苷类、氟喹诺酮类、头孢菌素类等存在多重耐药性。

表1 8种药物对4株分离鸡大肠杆菌的MIC测定结果Table 1 The MIC results of 8 antimicrobials against 4 chicken E.coli μg／mL

3 讨 论

当前，ESBLs的流行情况非常复杂，本试验采用CLSI方法对4株大肠杆菌进行了产ESBLs检测，同时也进行了药敏试验。由药敏试验结果可见，对于阿米卡星，产ESBLs的菌株与非产ESBLs菌株对各种药物的耐药情况对比非常明显，产酶菌的耐药明显大于不产酶菌。同时，产酶菌L1对氨基糖苷类、氟喹诺酮类等其他抗菌药物也产生耐药性，说明产酶菌对这些药物存在多重耐药性。本试验结果显示，产ESBLs的菌株对不同作用机制的抗菌药表现出较高的耐药性以及交叉耐药和多重耐药，故临床应加强对分离菌ESBLs的检测。

当前，在兽医临床用药时，由于养殖户缺乏基本的用药常识和不合理使用药物现象较为严重，不仅造成了大量药品的浪费，而且导致不良反应的增多、细菌耐药性的产生和兽药残留等现象，给兽医工作、公共卫生及人民健康等都带来了不良的后果［9］。再者，由于药物选用的不当，剂量与疗程的不合理，不恰当的联合用药，致使耐药菌株的增加，导致抗菌药物在临床治疗的失败［10］。由于耐药菌株的增加，致使耐酶菌株在同种或异种细菌间通过结合、转化、转导而转移，促使敏感菌变成耐药菌［11］。为了充分发挥抗菌药物的疗效，降低药物的不良反应，减少细菌耐药性的产生，提高药物治疗水平，我们必须切实合理地使用抗菌药物。

在西藏地区，针对产ESBLs菌株的复杂性以及临床的难治性，对其流行情况的检测和耐药分析，对临床指导合理使用抗菌药物显得尤为重要。

［1］ 张燕飞，王 东，王玉炯，等.宁夏部分地区鸡大肠埃希菌的分离与血清型鉴定［J］.动物医学进展，2012，33（5）：119-121.

［2］ 王利勤，王晶钰，董 睿，等.鸡源致病性大肠埃希菌中氨基糖苷类抗生素耐药基因的检测［J］.动物医学进展，2012，33（7）：49-53.

［3］ 徐树强，杨安龙，吴兆林，等.扬州地区鸡大肠杆菌的分离鉴定与药敏试验［J］.江苏农业科学，2006（6）：330-332.

［4］ Bradford P A.Extended-spectrum beta-lactamases in the 21 th century：characterization，epidemiology，and detection of this important resistance threat［J］.Clin Microbiol Rew，2001，14：933-951.

［5］ Saez Y，Zarazaga M，Brin L，et al.Antibiotic resistance in Escherichia coli isolates obtained from animals，foods and humans in Spain［J］.Int J Antimicrob Ag，2001，18（4）：353-358.

［6］ 刘保光，刘建华，吴 华，等.舒巴坦钠和EDTA使产ESBLs鸡大肠杆菌恢复对抗菌药物敏感性［J］.湖南农业大学学报，2010，36（3）：326-329.

［7］ Clinical and Laboratory Standards Institute.Performance Standards for Antimicrobial Disk and Dilution Susceptibility Tests for Bacteria Isolated from Animals Approved Standard［M］.3rd edn.Wayne：USA.（M31-A3）CLSI，2008a.

［8］ Clinical and Laboratory Standards Institute.Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing ［M］.Wayne：USA.18th Informational Supplement （M100-S16）CLSI，2008b.

［9］ 叶贺佳，叶万树，黄东璋.细菌耐药性的产生机理及其控制对策［J］.动物医学进展，2005，26（10）：33-38.

［10］ 刘栓江，杨汉春.鸡源大肠杆菌的耐药性监测［J］.中国兽医杂志，2004，40（6）：48-49.

［11］ 胡功政，张春辉，梁 军，等.猪鸡致病菌β-内酰胺酶、超广谱β-内酰胺酶检测与药敏试验［J］.中国农业科学，2005，38（2）：399-404.