E－钙粘蛋白在胚胎停育患者绒毛和蜕膜中的差异性表达＊

第四军医大学唐都医院（西安710038） 李三阳 李 怡 苗 卓 张 哲 尹国武

胚胎停育是指妊娠早期胚胎发育自然终止、胚胎丢失的病理过程，其妊娠结局常常为稽留流产和不全流产［1］。近年来胚胎停育患者有增加趋势，有研究表明滋养细胞增殖不良、浸润异常可能是导致早期胚胎停育的原因之一［2］。E－钙粘连蛋白（E－Cadherin，ECad）是一种钙依赖粘附分子，广泛表达于上皮细胞表面，其主要功能是介导特定组织或器官的同型细胞间粘附作用，维持上皮细胞层的完整性和极性，参与胚胎的发育及组织形成及细胞的转移、侵蚀等活动，其表达水平的升高会导致细胞的迁移及浸润能力下降，表达降低则会导致细胞迁移和浸润能力增强［3］。研究发现E－Cad在滋养细胞中也有表达，可以影响滋养细胞的浸润能力。我们应用荧光实时定量PCR（qRT－PCR）技术检测胚胎停育患者绒毛和蜕膜中E－Cad mRNA水平的表达量，进一步研究E－Cad mRNA的表达水平和胚胎停育的关系。

对象与方法

1 研究对象 选自2010年4～12月间来我院妇产科门诊就诊的胚胎停育患者50例，临床确诊为胚胎停育（B超检查宫腔内可见孕囊，未见胚芽或原始心管搏动）。所有对象均月经规律（月经周期28～32d），既往均无自然流产、死胎、死产史，无染色体、解剖、内分泌方面的异常以及感染、自身免疫性疾病史，且未采取任何药物干预。选择与胚胎停育组相同时期内到我院就诊的孕期10周以内此次妊娠期间无先兆流产症状，B超证实胚胎发育一切正常，要求停止妊娠的正常妇女50例为正常对照组。两组间年龄和孕周差异无统计学意义（P＞0．05）。见表1。

表1 绒毛和蜕膜标本详细资料（n＝50）

2 实验方法 ①器械的准备：弯盘、镊子等耐高温物品180℃6h，消除RNA酶，冻存管，枪头用0．1%DEPC水浸泡过夜，高压蒸汽灭菌，烤干备用。②绒毛和蜕膜标本的采集：两组患者于人流术后将吸出的组织倒入已消毒的弯盘中，用无菌生理盐水反复漂洗绒毛和蜕膜组织，用无菌纱布吸干表面的水分放入事先准备好的冻存管中，标记好放入液氮，－80℃保存备用。③组织RNA的提取及反转录：组织RNA的提取按照RNA Plus（大连宝生）逆转录TAKARA（大连宝生）的试剂说明书进行操作。④荧光实时定量PCR（qRT－PCR）：qRT－PCR 以 GAPDH 为内参照基因进行PCR扩增，每例样品均设4个平行重复孔。引物序列见表2（引物有北京奥科合成）。

表2 qRT－PCR引物序列表

3 统计学方法 采用SPSS14．0统计软件进行统计分析，数值均以±s表示，两组间计量资料的比较采用t检验。

结 果

1 qRT－PCR结果 应用紫外分光光度计测定RNA在260nm及280nm的吸光值。OD值均在1．8～2．0之间，表明RNA的质量良好。在绒毛标本中，E－Cad mRNA在实验组表达量高于对照组（t＝29．24，P＜0．05）。（见表3）。在蜕膜标本中，E－Cad mRNA在实验组表达量高于对照组（t＝19．76，P＜0．05）。（见表4）。

2 qRT－PCR结果的验证 qRT－PCR结果可能存在假阳性，我们对qRT－PCR产物用2%的琼脂糖凝胶电泳，结果显示E－cad在120bp，GAPDH在196bp处，目的条带在预期条带处。（胚胎停育患者与正常人流者绒毛和蜕膜qRT－PCR结果的验证分别见附图）。

表3 E－Cad在实验组和对照组绒毛中的表达（±s）

表3 E－Cad在实验组和对照组绒毛中的表达（±s）

注：与对照组相比＊P＜0．05

组 别 n E－Cad／GAPDH实验组 50 0．875±0．07＊对照组 50 0．337±0．11

表4 E－Cad在实验组和对照组蜕膜中的表达（±s）

表4 E－Cad在实验组和对照组蜕膜中的表达（±s）

注：与对照组相比＊P＜0．05

组 别 n E－Cad／GAPDH实验组 50 0．927±0．12＊对照组 50 0．512±0．08

附图 绒毛及蜕膜中qRT－RCP结果后验证

讨 论

人类的成功妊娠，需要来自胚胎的绒毛外滋养层细胞发挥类似肿瘤细胞浸润的特性。正常妊娠胎盘的发育过程中一部分早期滋养细胞浸润子宫蜕膜，分化成为具有侵蚀力的细胞表型，其深度可达子宫肌层内的1／3。妊娠早期，细胞滋养细胞（CTB）在胚泡植入子宫壁后即分化为绒毛滋养细胞和绒毛外滋养细胞（EVT）。其中EVT是具有浸润能力的滋养细胞，其浸润能力在滋养细胞正常侵入子宫肌层的过程中发挥重要作用［4］。因此，早期妊娠过程中滋养细胞对子宫肌层的适度浸润是妊娠成功的关键。

绒毛主要由滋养细胞分化而来，其主要成分为绒毛外滋养细胞，具有浸润功能。滋养细胞分化与浸润能力决定胎盘能否正常发育。E－Cad是钙依赖型细胞粘连糖蛋白，广泛表达于上皮细胞表面，介导同种细胞间的黏附作用，并连接细胞内骨架，影响细胞的分化与浸润能力。E－Cad介导的粘附系统是已被公认的“浸润抑制系统”，有研究表明E－Cad的表达与滋养细胞的分化浸润有一定的关系［5］，妊娠早期任何部位的细胞滋养细胞（CTB）表面均有E－Cad的粘附与表达，有利于胚泡的粘附和植入［6］。近来研究表明，E－Cad等粘附分子参与母胎界面微环境的构成，在胚胎着床和生长发育过程中均发挥着重要作用［4］。随着妊娠的进展，E－Cad在绒毛各部位的表达逐渐下降，这有利于滋养细胞的侵入，保证母胎之间正常生理功能的运行，封闭E－Cad可显著提高滋养细胞的浸润行为［7］。本研究发现胚胎停育绒毛中E－Cad在mRNA水平的表达低于正常人流者，研究结果与黄敬明相符。黄敬华等［8］用免疫组化的方法研究表明E－Cad在胚胎停育绒毛细胞滋养细胞表面表达增加。Shih等［9］研究发现升高E－Cad的表达水平后，发现滋养细胞的转移和侵蚀能力下降。E－Cad的表达水平可以有效的反应滋养细胞的浸润能力，表达水平过高则引起滋养细胞侵蚀能力不足，导致自然流产［10］。因此我们推测E－Cad在胚胎停育患者绒毛中的高表达引起滋养细胞浸润能力下降，无法有效完成血管重铸，造成胎盘浅着床，从而导致自然流产等妊娠结局。

蜕膜组织是子宫内膜间质受蜕膜化诱导因子刺激而增殖和再分化形成的一种特殊组织，子宫内膜的蜕膜和蜕膜功能的正常表达，对胚胎着床、妊娠建立与维持，以及分娩发动均起着极为重要的作用。E－Cad即为子宫内膜细胞表达的一种粘附分子，在钙离子存在的条件下，通过胞外区结构域之间的相互作用介导细胞与细胞的粘附。本研究用qRT－PCR技术发现在胚胎停育蜕膜中E－Cad在mRNA水平的表达高于正常人流组。刘芸等［11］证明在增殖期到分泌期，子宫内膜腺上皮细胞表达E－Cad逐渐增加，分泌晚期及蜕膜期表达降低，揭示E－Cad与胚泡的植入有密切关系。当滋养细胞需要进一步与子宫内膜相容时，如在分泌晚期和早孕期，上皮细胞表达E－Cad降低，使得细胞相互粘附力降低，有利于滋养细胞的侵入。结合本组实验结果，推测E－Cad在组织蜕膜组织中的表达增高可能影响胚胎的着床、妊娠建立与维持，导致胚胎停育等妊娠结局。

胚胎的成功着床取决于绒毛滋养细胞的侵入性和子宫内膜的容受性［12］。E－Cad在胚胎停育患者绒毛中的高表达引起滋养细胞浸润能力下降，无法有效完成血管重铸，造成胎盘浅着床，可能导致自然流产等妊娠结局。E－cad在蜕膜组织中的高表达可能影响滋养细胞与子宫内膜的容受性，进而影响胚胎的着床、妊娠建立与维持，导致自然流产等妊娠结局。因此，E－Cad在绒毛和蜕膜中的高表达可能通过上述机制影响胚胎发育导致自然流产，本研究可能为胚胎停育的机制提供新的诊断思路。

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