家蚕幼虫体中1-脱氧野尻霉素含量的变化

陈亚洁，刘淑梅，崔振腾，曾 鹏，金卫明，费建明，李玉峰，时连根

（1.浙江大学 动物科学学院，浙江 杭州 310058； 2.湖州市农业科学研究院，浙江 湖州 313000）

1-脱氧野尻霉素（1-deoxynojimycin，DNJ）是一种天然哌啶生物碱，最早由Yoshiaki等于1976从桑根和桑枝中分离获得[1]，此后从桑叶、野跖草、风信子等植物和浅紫灰链霉菌等微生物中也相继分离出DNJ[2～4]。由于DNJ具有高效竟争性抑制α-葡萄糖苷酶的药理活性，可被用于治疗糖尿病等疾病，所以受到国内外研究者的广泛关注[5～6]。家蚕（Bombyx mo⁃ri）为重要经济资源昆虫，其幼虫吃进桑叶，合成出有用物质，是一个高效的生物反应器。不同品系、不同品种的家蚕幼虫，具有不同的遗传特性、生长特点与物质代谢等，对桑叶的食下、消化、吸收等情况存在差异。这些因素是否会影响家蚕幼虫体中DNJ含量，探明这一问题对于合理开发利用家蚕幼虫体中DNJ具有积极意义。

1 材料与方法

1.1 家蚕幼虫粉

12个原种（菁松、皓月、浙蕾、春晓、春蕾、镇珠、秋丰、白玉、丰1、54A、薪杭、白云）和12个杂交种（菁松×皓月、皓月×菁松、浙蕾×春晓、春晓×浙蕾、春蕾×镇珠、镇珠×春蕾、秋丰×白玉、白玉×秋丰、丰1×54A、54A×丰1、薪杭×白云、白云×薪杭）由浙江省蚕种公司提供，1个多化性品种（MP）为本系种质资源与分子育种实验室保存。取不同品种家蚕，在不同季节用桑叶常规饲育至5龄第3 d，饥饿12 h后-70℃冷冻保存。使用冷冻干燥，低温超微粉碎并过80目筛，为供试验用的家蚕幼虫粉。

1.2 试剂及标准品及主要仪器

1-脱氧野尻霉素氢氯化合物（1-DEOXYNOJIR⁃IMYCIN Hydrochloride，DNJ-HCI）和9-芴基氯甲酸甲酯（9-Fluorenylmethyl chloroformate，FMOC-CI）均为SIGMA-ALDRICH公司产品；乙腈（色谱纯）和其它试剂（分析纯）均购自中国医药上海化学试剂公司；水为双重蒸水。

Waters 600高效液相色谱仪为Waters公司产品；CHRISTPHA2-4型冷冻干燥机为BMH INSTRU⁃MENTS（HK）CO.LTD产品；BFM-6BI低温超微粉碎机为济南倍力粉技术工程有限公司产品。

1.3 试样液的制备

精确称取家蚕幼虫体粉约0.02 g，以0.05 mol/L的HCI为溶剂，涡流15 s成悬浮液。超声波处理30 min后，用21690 g离心20 min，沉淀物再按上述步骤提取一次，合并两次上清液，定容得供试品液。

取10 μL 供试品液，与10 μL 0.4 mol/L硼酸钾缓冲液（pH8.5）混和。加入20 μL 5 mmol/L FMOC-CI（溶解在50%乙腈中），迅速混匀并在20℃水浴锅中反应20 min。加10 μL 0.1mol/L甘氨酸液，通过中和剩余的FMOC-CI来终止反应。反应液用950 μL 0.1%（V/V）醋酸液稀释，以稳定生成的DNJ-FMOC。用孔径0.2 μm尼龙吸管式过滤器过滤，收集滤过液即得试样液。

1.4 DNJ含量的测定

采用高效液相色谱法。色谱条件：色谱柱为DI⁃AMONSIC C18柱（250×4.60 mm，ID），流动相为乙腈-0.1%醋酸（1∶1，V/V），流速1.0 mL/min，柱温为室温（25℃），检测器为Waters 474荧光检测器（激发光254 nm，发射光322 nm），软件资料为Millennium32工作站，进样量10 μL，用外标法计算其含量。

2 结果与分析

2.1 不同性别家蚕幼虫体中DNJ含量的差异

调查秋丰×白玉5龄第3d幼虫体中DNJ的含量，雌蚕体为0.32%，雄蚕体为0.48%（表1）。结果显示不同性别蚕体中DNJ的含量存在差异，雄蚕体的高于雌蚕体，此结果与黄酮类化合物的含量[7]相一致。

表1 不同性别家蚕幼虫体中的DNJ含量Table 1 The quantity of DNJ in different sex silkworm larva

2.2 不同季节饲养家蚕幼虫体中DNJ含量的差异

调查不同季节用相同技术标准与桑叶饲养的秋丰×白玉5龄第3 d幼虫体中DNJ的含量，结果如表2所示。结果表明：同一蚕品种在不同饲养季节间，其幼虫体中DNJ的含量存在差异，春季饲养的＞秋季饲养的＞夏季饲养的。

表2 不同饲养季节家蚕幼虫体中的DNJ含量Table 2 The quantity of DNJ in silkworm larva reared on different season

2.3 不同品种家蚕幼虫体中DNJ含量的差异

分别取中系、日系、多化、春用、夏秋用的原种和杂交种共25个品种的5龄第3 d家蚕幼虫粉，测定其DNJ含量，结果如表3所示。结果表明：①家蚕幼虫体中DNJ的含量，在品种间存在明显差异，高低相差2.04倍；②供试品种除菁松（原种）和镇珠×春蕾（杂交种）外，杂交种蚕体中DNJ含量高于原种蚕体中DNJ含量；③多化性品种蚕体中DNJ含量除低于二化性品种白玉外，均高于中系和日系的二化性品种蚕体中含量，但中系与日系的二化性品种蚕体间，其DNJ含量互有高低。

表3 不同品种家蚕幼虫体中DNJ含量的差异Table 3 The quantity of DNJ in different variety silkworm larva

3 讨论

DNJ通过高效竟争性抑制机体小肠的α-糖苷酶活性，来降低机体肠道对碳水化合物的消化和葡萄糖的吸收，从而起到高效降低血糖的作用[5，6]。用家蚕幼虫制成的全蚕粉具有显著的降血糖作用，已分别由国内外学者Ryu 等8]、桂仲争等[9，10]、陈智毅等[11]、肖辉等[12]在动物实验和临床研究中得到了证实。本试验结果表明，家蚕幼虫体富含DNJ，并且其DNJ含量在不同品种、不同性别、不同饲养季节间存在明显差异。在供试的25个蚕品种中，DNJ含量最高的54A×丰1为0.53%，最低的54A为0.26%，二者相差2.04倍。雄蚕体中的DNJ含量高于雌蚕体中的含量；同一蚕品种在不同饲养季节间，其蚕体中DNJ含量，春季饲养的＞秋季饲养的＞夏季饲养的。本研究结果对于推进家蚕幼虫资源的药用开发以及制备高DNJ含量的家蚕幼虫体产品等，均具有积极的指导意义。

家蚕以桑叶为饲料，一般桑叶中DNJ含量约为0.11%，而家蚕幼虫体中DNJ含量均大大高于桑叶中DNJ含量，其中54A×丰1（0.53%）品种幼虫体中DNJ含量高出桑叶近5倍。此结果从一个侧面反映出了家蚕幼虫体具有累积或合成DNJ的机能，是累积作用还是合成作用，或者是二者均存在，还有待于通过分析比较桑叶中生物碱与蚕体中生物碱的种类、结构等来加于确定，此方面的研究工作正在进行中。

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