四倍体刺槐硬枝扦插生根过程中内源激素的变化

马振华 ，王吉斌 ，李才文 , 赵 鹏 ，赵 忠

（1.国家林业局 西北林业调查规划设计院，陕西 西安 710048；2.西北农林科技大学西部环境与生态教育部重点实验室，陕西 杨凌 712100；3.西北大学生命科学学院 西部资源生物与现代生物技术教育部重点实验室，陕西西安 710069）

四倍体刺槐硬枝扦插生根过程中内源激素的变化

马振华1，2，王吉斌1，李才文1, 赵 鹏3，赵 忠2

（1.国家林业局 西北林业调查规划设计院，陕西 西安 710048；2.西北农林科技大学西部环境与生态教育部重点实验室，陕西 杨凌 712100；3.西北大学生命科学学院 西部资源生物与现代生物技术教育部重点实验室，陕西西安 710069）

剪取四倍体刺槐当年生硬枝做插穗，研究了经不同浓度和时间外源激素IBA浸泡处理后对硬枝插穗生根的影响及生根过程中内源激素IAA、ABA、腺嘌呤、6-BA、GA的变化规律，以揭示四倍体刺槐插穗难生根的机理。研究表明：在四倍体刺槐硬枝扦插生根过程中，内源IAA、腺嘌呤、6-BA含量高低与扦插生根有显著相关性，在不定根形成期内源IAA、腺嘌呤、6-BA含量增加，不定根形成后IAA、腺嘌呤、6-BA含量降低；经较高浓度且较长时间外源IBA的处理会使得插穗内源IAA、腺嘌呤和6-BA含量在愈伤组织诱导期含量快速增加，是促使扦插生根的有利条件；在生根过程中，IAA与ABA呈相反变化趋势的现象，即不定根形成期IAA含量处于高峰期时，ABA含量处于低峰期；GA含量在整个生根期的变化基本表现为一直下降的趋势，且GA含量的变化与插穗生根无明显关系。

四倍体刺槐；硬枝扦插；内源激素

四倍体刺槐tetraploid Robinia pseudoacacia是1997年从韩国引进的人工诱变刺槐新品种，分为饲料型和速生型2个类型。由于刺槐具有较强的适应性、速生性，加之用途广泛而被许多国家引种栽培，与杨树、桉树一起被称为世界上引种最成功的3大树种之一。大量研究表明，四倍体刺槐属于难生根树种，生产上主要以嫁接繁殖为主，繁殖速度慢、数量少、成本高，使得四倍体刺槐的推广种植在很大程度上受到了制约。因此，为了提高刺槐的扦插成活率，解决四倍体刺槐种苗繁殖的技术难题，笔者对四倍体刺槐的硬枝扦插繁殖技术及其生根过程中插穗内部的生理生化反应、促进和抑制生根的机制、各种内源激素水平的变化情况进行了试验和研究。

刺槐属于难生根树种，一般认为扦插成活很难，成活率不稳定。周全良等[1]采用正交和随机区组设计，发现刺槐硬枝对NAA、IBA两种药剂反应均敏感，两种药剂均有促进生根作用。单独使用时,两种药剂之间以及浓度500 mg/kg与1000 mg/kg之间效果相差不大；两种药剂适当浓度的混合使用会产生更佳效果,以NAA 500 mg/kg和IBA 500 mg/kg等量混合使用效果最好。周全良等[2]还探讨了药剂处理、覆膜措施、插穗规格等因素对刺槐优良无性系硬枝扦插繁殖效果的影响，认为影响其成活率的主要因素是覆膜措施、插穗粗度、插穗长度和药物处理，且插穗于土壤中腐烂是降低成活率的重要原因。郭建和[2]等根据刺槐具有复生隐芽的生物学特性，即刺槐枝条的每个芽眼都能复生好多隐芽，一芽可进行多次萌发，采用2次抹芽(分别在扦插后20 d和27 d)的措施，利用当年生硬枝进行扦插育苗，获得较高的成活率。四倍体刺槐用传统的硬枝扦插法成活率很低，大约只有3%,但使用改进的方法可使成活率达到40%左右[3]。

1 试验方法与材料

1.1 试验方法

试验于2006年12月9日在陕西杨陵西北农林科技大学林学院苗圃进行。实验采用电热温床阳畦育苗法，畦长5 m,宽2 m 南墙高于床面30 cm，北墙高于床面80 cm；畦内底层铺15 cm厚河卵石，其上铺5 cm厚干净河沙，再铺3 cm厚锯末作为隔热层，此时将地热线布设其上，按要求布线，每行间隔10 cm，来回布线，布线时要求线与线之间不能重叠或交叉，更不能扭结，以防通电时烧断。上层再铺25 cm厚河沙。电热线功率为800瓦，长200 m，以保持苗床温度恒定。

1.2 试验设计

试验采用随机区组设计，共设南北2个区组，在边缘留出3行隔离带。先将剪好的插穗用多菌灵浸泡消毒10 min，然后将插穗基部1～2 cm处分别用IBA生长素浸泡，质量浓度分别为50、200和500 mg/kg，浸泡时间分别为1、5和8 h，以清水浸泡为空白对照，每个处理插穗80株。

1.3 试验材料及处理

插穗是剪取四倍体刺槐无性系嫁接苗的当年生硬枝。采条时选择粗度为1～2.5 cm的插条，先将采来的插条稍部截去1 m，基部截去0.5 m，然后留下中部作为扦插用的插条，将其剪截为长15～20 cm的插穗，上端距上芽1 cm处剪成平口，下端距下芽0.5 cm处剪成马蹄形。最后将插穗插于沙床上，扦插深度12 cm左右，上端露出沙床5～7 cm。扦插后每天观测并记录畦内土壤温度和畦内空气温度，注意通风透气，以防高温烧苗，每一周浇一次透水，保持插穗正常生长所需水分。扦插前先用多菌灵液对沙床进行消毒，然后每隔1周喷施1次30～40 g/L的多菌灵。

1.4 样品采集

从扦插后第1 d开始采样，每隔15 d采一次，共采3次，每个处理采3个重复随机采取。注意采样时将采得的插穗用清水冲洗干净，然后将插穗上的水滴擦干，立即剥下插穗皮部，迅速放入事先准备好的盛满液氮的容器进行低温保存，以防插穗皮部失活，然后带入实验室保存在超低温冰箱以待测定。

1.5 指标测定及方法

测定指标有IAA、GA、ABA、腺嘌呤、6-BA、IBA。测定方法采用液相色谱法。岛津SCL-10A VP高效液相色谱仪；岛津SPD-10A VP UV-检测器；Class-VP液相色谱工作站； 色谱柱为 Shim-Park C18 VP-ODS (150 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为甲醇/0.075%乙酸[V(CH3OH)/V(CH3COOH)＝45/55]，检测波长254 nm，流速0.7 mL/min。手动进样，进样量10 μL，柱温30℃。

2 结果与分析

2.1 根原基的变化

试验观察发现，在扦插后第9 d时大部分处理插穗基部开始有愈伤组织生成，第15 d时,所有处理的插穗切口外沿形成了愈伤组织，到20 d时部分处理的插穗有根形成，30 d，除对照外各处理都有插穗生根。观察统计阳畦内平均气温为22 ℃，插床以下5 cm深平均地温26 ℃，10 cm深平均地温28 ℃，15 cm深时平均地温30 ℃。第40 d的调查统计生根率情况见表1。由表1可以看到生根率高于40%的处理有500 mg/kg 8 h和200 mg/kg 5 h,生根率分别为51.3 %和41.7 %，其他处理的生根率都低于30 %。

表1 四倍体刺槐硬枝扦插后30 d生根率Table 1 Tetraploids R. pseudoacacia rooting rate after cuttings rooting

2.2 IAA含量的变化

从图1可以看出，在50 mg/kg的处理组中，插穗体内的IAA含量在0～15 d期间下降，15～30 d期间上升。在200 mg/kg和500 mg/kg 的处理组中（见图2、图3），插穗体内的IAA含量在扦插后0～15 d期间上升，在15～30 d期间含量下降。另外，测定结果显示，经500 mg/kg 8 h浸泡处理后，内源IAA含量增加达到最高，为0.024 8 mg/g；最低为50 mg/kg 5 h的处理，内源IAA含量为0.002 7 mg/g。说明高浓度的外源IBA能有效促进内源IAA含量的提高。对第15 d时各处理的IAA含量与40 d时的生根率进行相关性分析显示，两者间存在极显著正相关，相关系数为0.802（注：n=10，*p＜ 0.05，|r|=0.6319；**p＜0.01，|r|=0.7155）；扦插后30 d时两者间的相关系数为0.640 7（注：n=10，*p＜0.05， |r|=0.631 9；**p＜0.01，|r|=0.715 5），说明扦插后第30 d时IAA含量的高低与四倍体刺槐生根也有着显著的正相关性。因此，在四倍体刺槐硬枝扦插过程中，生根前期和生根后期IAA含量的高低对生根率都有重要的影响较高含量的内源IAA能有效促进生根。

图1 50 mg/kg生长素处理后IAA含量的变化Fig. 1 Variations of IAA content treated by auxin (50 mg/kg)

图2 200 mg/kg生长素处理后IAA含量的变化Fig. 2 Variations of IAA content treated by auxin (200 mg/kg)

图3 500 mg/kg生长素处理后IAA含量的变化Fig. 3 Variations of IAA content treated by auxin (500 mg/kg)

2.3 ABA含量的变化

在扦插生根过程中测定ABA含量发现：在0～30 d期间，各处理的内源ABA变化趋势高度一致（见图4、5、6），表现为先降低后增加，在0～15 d期间ABA含量下降，15～30 d期间含量上升。这说明在四倍体刺槐扦插生根过程中IAA与ABA的水平呈相反的变化趋势，即不定根形成期IAA含量处于高峰期时，ABA含量处于低峰期。对各处理第15 d时ABA含量与各处理40 d时的生根率进行相关性分析显示，ABA含量的变化与四倍体刺槐扦插生根率无显著相关性，相关系数0.4509（ 注：n=10，*p＜ 0.05，|r|=0.6319；**p＜0.01，|r|=0.7155）。说明在生根以前插穗体内ABA含量的高低与插穗不定根的形成关系不紧密。对第30 d时各处理ABA含量与各处理40 d时的生根率进行相关性分析显示，相关系数为-0.1696（注 n=10, *p＜ 0.05，|r|=0.6319； **p＜ 0.01，|r|=0.7155），说明扦插后第30 d时ABA含量的高低与四倍体刺槐生根无显著的相关性。因此，扦插后第30 d时ABA含量的高低与四倍体刺槐的生根率无紧密联系。这可能是由于ABA并不是单一的影响插穗生根的因素，而是与其他激素共同调节着插穗的生根。

图4 50 mg/kg生长素处理后ABA含量的变化Fig. 4 Variations of ABA content treated by auxin (50 mg/kg)

图5 200 mg/kg生长素处理后ABA含量的变化Fig. 5 Variations of ABA content treated by auxin (200 mg/kg)

图6 500 mg/kg生长素处理后ABA含量的变化Fig. 6 Variations of ABA content treated by auxin(500 mg/kg)

2.4 腺嘌呤含量的变化

在四倍体刺槐不定根形成的过程中，从50 mg/kg处理组中（见图7）看出，在0～15 d期间腺嘌呤含量下降，15～30 d期间腺嘌呤含量上升。从200 mg/kg和500 mg/kg的处理组中看出（见图8、图9），在0～15 d期间腺嘌呤含量上升，15～30 d期间腺嘌呤含量下降。其中，经500 mg/kg 8 h外源IBA的处理腺嘌呤含量在0～15 d期间上升幅度最大，说明较高浓度且较长时间外源IBA的处理能促使插穗体内腺嘌呤含量的快速上升，形成对生根的有利条件。对第15 d时各处理腺嘌呤含量与各处理第40 d时生根率进行相关性分析显示，相关系数为0.912**（注：n=10，*p＜ 0.05，|r|=0.6319；**p＜ 0.01，|r|=0.7155），说明生根前插穗体内的腺 嘌呤含量对四倍体刺槐硬枝扦插生根率高低有显著影响。对第30 d时腺嘌呤含量与各处理40 d时的生根率进行相关性分析显示，相关系数为0.1581（注：n=10，*p＜0.05，|r|=0.6319；**p＜0.01，|r|=0.7155），说明扦插后第30 d时腺嘌呤含量的高低与四倍体刺槐生根也无显著的相关性。说明生根后腺嘌呤含量的高低与四倍体刺槐硬枝生根率关系不大。

图7 50 mg/kg处理后插穗腺嘌呤含量的变化Fig. 7 Variations of adenine phosphate content treated by auxin (50 mg/kg)

图8 200 mg/kg处理后插穗腺嘌呤含量的变化Fig. 8 Variations of adenine phosphate content treated by auxin (200 mg/kg)

图9 500 mg/kg生长素处理后腺嘌呤含量的变化Fig. 9 Variations of adenine phosphate content treated by auxin (500 mg/kg)

2.5 6-苄氨基嘌呤含量的变化

经外源IBA诱导后的各处理中，插穗体内的6-BA含量在0～15 d期间上升，15～30 d期间6-BA含量下降（见图10～图12）。对所有处理第15 d时6-BA含量与插后第40 d时生根率进行相关性分析显示，6-BA含量增加与40 d时插穗生根率有极显著的正相关性，相关系数为0.931**（注：n=10，*p＜0.05，|r|=0.6319;**p＜0.01，|r|=0.7155），说明插穗扦插后0～15 d时6-BA含量的增加对促进四倍体刺槐生根率的提高作用极显著。说明扦插后第15 d时6-BA含量的变化与四倍体刺槐插穗生根有密切关系。对第30 d时6-BA含量与各处理40 d时的生根率进行相关性分析显示，相关系数为-0.2848（注：n=10，*p＜0.05，|r|=0.6319； **p＜0.01，|r|=0.7155），说明扦插后第30 d时6-BA含量的高低与四倍体刺槐生根也无显著的相关性。说明扦插后第30 d时的6-BA含量变化与四倍体刺槐硬枝生根关系不大。

图10 50 mg/kg生长素处理后6-BA含量的变化Fig. 10 Variations of 6-BA content treated by auxin(50 mg/kg)

2.6 GA含量的变化

图11 200 mg/kg生长素处理后6-BA含量的变化Fig. 11 Variations of 6-BA content treated by auxin(200 mg/kg)

图12 500 mg/kg处理后插穗6-BA含量的变化Fig. 12 Variations of 6-BA content treated by auxin(500 mg/kg)

在不定根的形成过程中，从50 mg/kg 的处理组中（见图13）看出，在0～15 d期间GA含量下降，15～30 d期间各处理的GA含量变化不大；从200 mg/kg和500 mg/kg的处理组中看出（见图14、图15）看出，在整个生根过程中(0～30 d) 期间GA含量一直下降。对所有处理扦插后第15 d时GA含量与第40 d时的生根率进行相关性分析显示，GA含量的降低与生根率无显著相关关系，相关系数为-0.0107（注：n=10，*p＜ 0.05，|r|=0.6319;**p＜ 0.01，|r|=0.7155）说明生根前GA含量的高低与四倍体刺槐硬枝扦插生根无紧密联系。对第30 d时GA含量与各处理40 d时的生根率进行相关性分析显示，相关系数为-0.042 6（ 注：n=10，*p＜ 0.05，|r|=0.6319；**p＜0.01，|r|=0.7155），说明生根后GA含量的高低与四倍体刺槐生根也无显著的相关性。

图13 50 mg/kg生长素处理后GA含量的变化Fig. 13 Variations of GA content treated by auxin(50 mg/kg)

图14 200 mg/kg生长素处理后GA含量的变化Fig. 14 Variations of GA content treated by auxin(200 mg/kg)

图15 500 mg/kg处理后插穗GA含量的变化Fig. 15 Variations of GA content treated by auxin(500 mg/kg)

3 结果与讨论

植物激素是控制植物生长发育的最重要物质之一。很多有关植物不定根发生过程中生长素变化的研究表明，根形成阶段需要较高浓度的内源IAA[4-5]。在植物发育的不同阶段，不同种类的内源激素含量呈规律性变化。外源生长素处理插穗促进内源IAA 向组织基部运输，插穗内源IAA 积累，进而诱导生根[7]。徐继忠等[8]的研究表明，桃树硬枝插穗根原基形成过程中，IAA 含量逐渐升高，在不定根突出表皮前，IAA 含量达到高峰。很多植物扦插生根的[12-13]研究表明，经外源IAA或IBA的诱导能显著提高植物的扦插生根率。在四倍体刺槐硬枝扦插试验中，发现植物激素IAA在四倍体刺槐扦插生根过程中有着显著作用，0～15 d时 IAA含量上升，15～30 d 时IAA含量下降，并且扦插生根后第15 d时IAA含量的增幅与生根率成呈正相关关系。经高浓度、长时间的IBA植物生长调节物质的诱导可显著提高IAA含量。

脱落酸作为植物天然抑制性植物激素,对植物的扦插生根起着抑制作用，这一点已在许多树种的扦插生根试验中发现。詹亚光等[4]在白桦插穗生根的研究结果表明，在白桦插穗生根过程中，IAA和ABA呈相反趋势，IAA含量的高峰时ABA含量下降至低谷，IAA是促进白桦插穗生根的主要植物激素，而ABA是抑制生根的主要植物激素。有的研究认为ABA 对插穗生根有抑制作用，难生根树种插穗ABA 含量要比易生根的高[9]； 有的研究则认为在不定根形成的整个过程中，内源ABA 含量对不定根的形成是有利的，根原基启动与生长发育阶段需要较高浓度的ABA 伴随[10]。在四倍体刺槐硬枝扦插试验中，ABA含量在0～15 d时下降，15～30 d时ABA含量上升，与IAA的变化趋势正好相反，研究发现ABA含量的变化与四倍体刺槐生根无紧密联系。

通过测定插穗体内细胞分裂素腺嘌呤和6-BA发现，在四倍体刺槐生根过程中发现，腺嘌呤和6-BA与四倍体刺槐硬枝扦插生根有紧密联系，扦插后第15 d时腺嘌呤和6-BA含量与插穗生根率有极显著的呈正相关性，0～15 d时6-BA含量的增加对促进四倍体刺槐生根率的提高作用极显著，而且经高浓度、长时间的外源IBA的处理，会促进腺嘌呤和6-BA含量的显著增加。

关于赤霉素在不定根发生过程中变化的观点不一。长白落叶松Larix olgensis扦插试验表明，GA的含量增加与插穗的愈伤组织形成、不定根的产生呈现正相关性[4]。经500 mg/kg 8h的IBA植物生长调节物质的诱导可显著降低GA含量[11]，形成了对生根有利的条件。该实验研究发现，植物激素GA含量在四倍体刺槐硬枝扦插生根过程中(0～30 d)呈下降趋势，分析插穗生根与GA含量的变化无显著相关性。

综上所述，在四倍体刺槐嫩枝和硬枝扦插试验中，植物激素与扦插成活有着重要影响。IAA、6-BA、及腺嘌呤含量升高的同时，GA、ABA含量下降，他们之间相互协调、共同作用下影响着四倍体刺槐的扦插生根，任何一种激素的不协调变化都会引起反作用。因此，找到合适的植物生长调节物质、以及植物生长调节物质的处理浓度、处理时间是四倍体刺槐扦插成活的关键。当然，刺槐无性系扦插繁殖成功与否及效果好坏,受多种因素制约，例如插穗营养、水分的多少也是影响扦插成活的重要条件。因此,采用适当的综合措施是提高扦插成活率和苗木质量的关键。所以在插穗年龄、插穗粗度、插穗长度和药物处理、消毒、覆盖、药物处理时间等措施上都要注意。

[1] 周全良,许明怡,李 丰,等.刺槐优良无性系硬枝扦插繁殖技术研究[J]. 宁夏农林科技, 1996,(5):14-19.

[2] 郭建和,徐 萍,王春雷,等.刺槐硬枝扦插抹芽促生根[J].林业实用技术,2002,(3):28.

[3] 李海民.退耕还林(牧)先锋树种——四倍体刺槐[J]. 林业实用技术,2004,(1):3-6.

[4] 詹亚光,杨传平,金贞福,等.白桦扦插生根的内源激素和营养物质[J].东北林业大学学报，2001,29(4):1-4．

[5] 许晓岗,汤庚国,谢寅峰.海棠果插穗的内源激素水平及其与扦插生根的关系[J].莱阳农学院学报，2005,22(3):195-199.

[6] 刘关君,李绪尧,由香玲,等.长白落叶松插穗内源激素变化与不定根产生的关系.

[7] Gatineau F, Fouche J G, Kevers C, et al. Quantitative variations of indolyl compounds including IAA, IAA-aspartate and serotonin in walnut microcuttings during root induction[J].BiolPlant, 1997,39:131-137.

[8] 徐继忠，陈四维. 桃硬枝插条内源激素( ABA、IAA) 含量变化对生根的影响[J].园艺学报，1989,(4):275-278.

[9] 迟 彦，侯义龙，于亚军，等. 芽变毛白杨及其亲缘种扦插生根过程中内源激素含量的动态变化［J］． 安徽农业科学，2007,35(27):8438-8439，8442．

[10] 林士杰,姜 静,冯 昕,等.黑林1号杨组培叶片不定根的发生与内、外激素关系的研究[J].林业科技,2006,31(1):8-11.

[11] 王文凤,李保会,张 芹,等. IBA处理对蒙椴嫩枝扦插的影响[J]. 河北农业大学学报，2007, 30(5):48-50.

[12] 韩艳英,叶彦辉,魏丽萍,等. 不同质量浓度吲哚乙酸对杨树硬枝扦插生根的影响[J].中南林业科技大学学报,2012, 32(3):81-84.

[13] 邓文韬, 张日清, 袁德义.植物生长调节剂对菲油果嫩枝扦插生根的影响[J]. 中南林业科技大学学报，2011,31(3):160-163.

Studied on endogenous hormones changes in the course of cutting and rooting of tetraploid Robinia pseudoacacia hard green branches

MA Zhen-hua1,2, WANG Ji-bin1, LI Cai-wen1, ZHAO Peng3, ZHAO Zhong2

(1. Northwest Forestry Exploring Institute of China State Forestry Administration, Xi’an 710048, Shaanxi, China; 2. College of Forestry,Northwest A & F University, Yangling 712100, Shaanxi, China; 3. Key Lab. of Resource Biology and Biotechnology in Western China Attached to China Ministry of Education, College of Life Science, Northwest University, Xi’an710069, Shannxi, China)

The tetraploid Robinia pseudoacacia hard cuttings were immersed in different concentrations exogenous hormone IBA and with different time treatments, then which was used to determine the effects of the treatments on the cuttings’ rooting rates and on the variations of endogenous hormones IAA, ABA, adenine phosphate, 6-BA, GA, and IBA in the process rooting. The results show that there were significant correlations between the rooting rates and endogenous hormones IAA content, adenine phosphate content, and 6-BA content，and in the adventitious root formation stage, the endogenous hormones IAA content, adenine phosphate content, 6-BA content increased, while after the adventitious roots were completed, IAA content, adenine phosphate content, 6-BA content decreased;with the high concentration and long time exogenous hormone IBA treatments, in the callus induction stage, the cuttings’ endogenous hormones IAA content, adenine phosphate content, 6-BA content could fast increased, which was propitious to promote the rooting of the hard cuttings; during the rooting process, the change tendency of IAA and ABA was contrary to each other, namely when in the adventitious root formation stage, the IAA content was in peak period but the ABA content was in low peak period. The results indicate that the rooting rates were not only influenced by the ABA, but also by the other hormones; there was no significant correlation between GA content and rooting rate and the content of GA decreased progressively during the cuttings rooting.

tetraploid Robinia pseudoacacia; hard branch cuttings; endogenous hormones

S792.27

A

1673-923X(2013)06-0026-07

2013-01-16

国家自然科学基金项目( 30972352; 31200500)

马振华（1982-），男，宁夏吴忠人，工程师，主要研究方向为森林培育理论与技术，森林调查与规划设计；E-mail: hua1928 @sina.com

赵 忠（1958-），男，甘肃庆阳人，教授，博士生导师，主要研究方向为森林培育理论与技术；E-mail: zhaozh@ nswsuaf.edu.cn

[本文编校：欧阳钦]