低氧预防运动性低血色素中TMPRSS6对机体铁代谢的调节

2012-12-29刘玉倩王海涛李海洲宋文靖

体育科学 2012年10期

刘玉倩，王海涛，李海洲，王羽，宋文靖

刘玉倩1，王海涛1，李海洲2，王羽1，宋文靖1

目的：阐明跨膜丝氨酸蛋白酶6（TMPRSS6）在低氧预防运动性低血色素中对机体铁状态的调节机制，为预防运动性低血色素发生提供理论基础。方法：24只雄性Wistar大鼠随机分为安静对照组（CG）、运动性低血色素组（EG）和运动后低氧恢复组（HE），分别用ELISA检测了血清铁代谢指标，RT－PCR检测肝铁代谢相关基因表达。结果：1）HE组Hb、SF、骨髓铁显著高于EG（Hb：HE：139.56±10.24g／L，EG：113.16±17.36g／L，P＜0.01；SF：HE：29.72±2.85ng／mL，EG：18.23±3.57ng／mL，P＜0.01；骨髓铁：HE：75.98± 7.08μg／g，EG：62.19±8.98μg／g，P＜0.05）。2）HE组肝HIF－1和TMPRSS6mRNA显著高于EG（P＜0.05）。3）HE组m－HJV和hepcidin mRNA和肝铁显著低于EG（肝铁含量：HE：80.18±13.66μg／g，EG：111.51±12.64μg／g，P＜0.01）。结论：从组织层面和分子生物学层面上进一步支持和完善了低氧对铁代谢的调控模型：通过HIF－1刺激TMPRSS6高表达，降低hepcidin，从而促进肝释铁蛋白FPN1表达，贮存铁释放，满足运动中机体合成Hb对铁的需求，这可能是防止运动性低血色素发生的原因之一。

跨膜丝氨酸蛋白酶6；低氧；运动性低血色素；鼠；动物实验

跨膜丝氨酸蛋白酶6（transmembrance serine proteases 6，TMPRSS6，也称为matriptase－2）是2008年Du等发表在《Science》上的论文首先报导的肝抗菌多肽（Hepcidin）的第一个负调节子，而高表达的hepcidin会抑制肠铁吸收，引发运动性低血色素。因此，TMPRSS6的正常表达对维持机体铁的动态平衡和红细胞生成起到重要作用［12，19］。国内、外一些研究表明，运动员依然普遍存在运动性铁缺乏［13，14］，而铁参与氧的转运、贮存与利用及ATP合成等许多生理过程，铁对呼吸和能量代谢都具有重要的影响［3］。此外，适度低氧条件下EPO显著升高，促进红细胞生成，提高运氧能力。在大强度运动过程中机体通过适宜低氧刺激，对预防运动性低血色素的调节作用还需深入研究。因此，本文研究了TMPRSS6在低氧防治运动性低血色素中对组织铁分布、肝脏铁调节蛋白的调控作用。

1 研究方法

1.1 动物分组和运动方案

雄性Wistar大鼠24只，体重250±10g，购自河北医科大学动物养殖中心，选用国家标准啮齿类动物干饲料喂养（铁含量为100mg／kg），自由饮水。环境温度22℃～24℃，相对湿度为45%～55%。将大鼠随机分为安静对照组（control group，CG）、运动性低血色素组（exercise－associated anemia group，EG）和运动后低氧恢复组（hypoxia after exercise group，HE），每组各8只。低氧运动组每天在低氧舱8h。采用常压低氧舱在13.6%的氧浓度（相当于海拔3 500m）［5］。运动性低血色素模型参考赵杰修等的运动方案［6］：跑台坡度为0，30m／min，6d／week，前2周1次／天，后2周2次／天。第1次训练时间为1min，每次递增2min。训练4周，最后1次训练时间为71min。运动后4周末取材。

1.2指标检测方法

用血细胞自动分析仪（MEK－6318K）测定血常规。取血清－80℃保存；大鼠用DEPC生理盐水灌流后取肝50～100mg，迅速投入液氮中以备做RT－PCR。原子吸收分光光度计（AA240FS，VARIAN）测定肝和骨髓总铁含量。Western Blot检测肝脏膜铁转运蛋白1（ferroportin 1，FPN1）（ADI）的表达，统计目的蛋白与β－actin的MaxOD比值。RTPCR法测定大鼠肝铁代谢相关基因mRNA，PCR引物碱基序列参考DIDIER等［10］和Zhang等［22］的报道［4，17］，上海生工合成，内参为β－actin［1］。血清EPO、铁蛋白（Serum Ferritin，SF）测试，采用双抗体夹心酶联免疫吸附实验（ABC－ELISA），EPO、SF试剂盒（Abcam，USA），严格按试剂盒说明书操作。1.3 结果统计与分析

所有数据一律采用SPSS 18.0进行单因素方差分析（UNIANOVA），多重比较采用SNK法。实验数据以平均数±标准差±SD）表示，显著性水平为P＜0.05，非常显著性水平为P＜0.01。

2 结果

2.1 各组大鼠血常规和血清铁状态比较

表1显示，EG组Hb、RBC和Hct显著低于CG和HE组，说明4周递增负荷跑台运动诱发大鼠产生了运动性低血色素（P＜0.01），而低氧则促进Hb的恢复。EG和HE组的EPO显著高于CG组（P＜0.01）。EG组血清SF含量低于CG和HE组（P＜0.01）。

2.2 运动和低氧对铁在大鼠各器官铁分布的影响

表2显示，EG组骨髓铁含量显著下降（P＜0.01），肝铁含量高于HE（P＜0.01）。HE组骨髓铁含量高于EG组（P＜0.05），肝铁含量显著低于EG和CG组（P＜0.01）。

表1 本研究运动后各组大鼠血常规和血清铁状态比较一览表Table 1 Effects of Treadmill Running on Blood Parameters，Serum Iron Status in Rats （，n＝8）

注：与CG相比：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；与EG相比：＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；下同。

安静对照组（Control group，CG）运动性低血色素组（Exercise－associated anemia group，EG）运动后低氧恢复组（Hypoxia after exercise group，HE）Hb（g／L） 147.11±5.51 113.16±17.36＊＊ 139.56±10.24＃＃红细胞计数（1012／L）（Red blood cell count，RBC） 7.38±0.38 5.73±1.22＊＊7.02±1.17＃红细胞压积（%）（Hematokrit，Hct） 41.05±0.95 34.17±2.68＊＊ 39.85±1.13＃促红细胞生成素（mIU／mL）（Erythropoietin，EPO） 17.79±2.35 31.88±5.29＊＊ 28.53±3.28＊＊血清铁蛋白（ng／mL）（Serum，ferritin，SF） 32.27±1.43 18.23±3.57＊＊ 29.72±2.85＃＃

2.3 低氧恢复对大鼠肝铁代谢相关基因mRNA表达的影响

图1显示，HE组肝脏的HIF－1和TMPRSS6mRNA显著高于CG和EG组（P＜0.01，P＜0.05）；肝铁调素调节蛋白（hemo juvelin，m－HJV）和hepcidin的mRNA低于CG和EG组（P＜0.01，P＜0.05）。EG组TMPRSS6mRNA低于CG组（P＜0.05）。

2.4 低氧恢复对大鼠肝FPN1蛋白表达的影响

HE组肝FPN1表达显著高于CG和EG组（P＜0.01），CG与EG两组肝的FPN1表达无明显差别。

研究结果表明，长时间、大强度运动引起机体Hb下

3 讨论

3.1 运动后低氧恢复对机体铁状态的影响

降，而运动后的低氧恢复很好地缓解了Hb下降的趋势。增高的Hb有利于运动中氧的转运和利用。低氧引起Hb增多主要是由于低氧刺激促进肾脏合成EPO增多，从而提高了机体红细胞和血红蛋白的水平［7］。长时间、大强度运动引发的运动性低血色素组和运动后低氧恢复组的EPO值均高于对照组，但运动性低血色素组的Hb水平较低，这说明除了EPO，还有其他因素影响Hb含量。Hb含有4个血红素铁，因此，机体铁状态是影响Hb合成的重要因素。运动性低血色素组的血清铁蛋白（SF）水平较低。而SF与机体贮铁量高度相关，1μg／L的血清铁蛋白相当于8～10mg的贮存铁，因此，临床上经常把血清铁蛋白作为反映机体铁状态的敏感指标［2］。实验结果表明，运动性低血色素组的铁贮量低于低氧恢复和对照组，虽然运动性低血色素组EPO含量较高，但由于无法获得充足的铁，仍会影响运动中Hb和肌红蛋白（myoglobin，Mb）及参与能量代谢的细胞色素酶的合成，从而影响机体对氧的转运和利用。

表2 本研究各组大鼠不同器官铁分布的比较一览表Table 2 Effects of Treadmill Running on Iron Storage in Rats （，n＝8）

安静对照组（Control group，CG）运动性低血色素组（Exercise－associated anemia group，EG）运动后低氧恢复组（Hypoxia after exercise group，HE）骨髓总铁含量（μg／g）（Iron storage in bone marrow） 81.83±5.79 62.19±8.98＊＊ 75.98±7.08＃肝脏总铁含量（μg／g）（Iron storage in liver） 107.44±7.41 111.51±12.64 80.18±13.66＊＊＃＃

3.2 低氧对机体贮存铁重新分布的影响

在运动过程中，机体内的铁会发生重新分布，铁从一些贮铁器官运送至利用铁的器官。肝脏是重要的贮铁器官，FPN1是位于细胞膜上的铁释放蛋白，广泛存在于十二指肠吸收细胞基底侧、肝细胞和巨噬细胞中，主要作用是将细胞内的铁转运至循环系统［11］。低氧恢复组肝细胞FPN1的表达显著高于对照组和运动性低血色素组，增加的FPN1促进肝细胞内贮存铁的释放，满足运动中机体对铁的需求，减少机体对骨髓铁的动用。这就可以解释结果中运动后低氧恢复组的肝脏铁含量降低，骨髓铁与对照组相比却无明显变化，但高于运动性低血色素组。而运动性低血色素组的肝脏贮存铁无明显变化，骨髓铁含量明显减少，这可能是机体铁代谢紊乱所致，具体机制尚需进一步探讨。

FPN1的表达主要受肝分泌的抗菌多肽hepcidin的负调控［9］。高表达的hepcidin可与FPN1结合，促进FPN1内化，失去转运铁的功能。而运动后低氧恢复组肝hepcidin的mRNA显著低于对照组和运动性低血色素组，减少了对肝细胞FPN1的抑制，促进肝贮存铁的释放。

3.3 低氧环境中TMPRSS6对hepcidin的调节机制

TMPRSS6主要是通过负调控肝抗菌多肽（hepcidin）而调节机体铁的动态平衡［12］。2011年有研究报道，低氧诱导因子（hypoxia－inducible factor，HIF）可能是TMPRSS6的上游调节因子［16］。HIF包括HIF－1和HIF－2。相对HIF－2，HIF－1的研究较为深入。二者在低氧条件下对机体的调控作用有所区别。HIF－1作为机体低氧应答的关键因子，可诱导多种与铁代谢相关蛋白的表达而影响机体的造血、铁代谢等功能［21］。这种依赖HIF的调控通路会增加TMPRSS6表达，促进细胞膜上HJV脱落，降低肝细胞hepcidin的表达［15，20］。而在低氧环境中可通过降低肝细胞瘤中SMAD信号而抑制hepcidin表达［8］。HIF－2则可能主要参与了肠铁吸收的调控［18］。低氧恢复组肝脏 HIF－1和 TMPRSS6的表达显著高于对照组和运动性低血色素组，而m－HJV的表达显著低于其他两组，也进一步说明低氧促进HIF－1和TMPRSS6表达，降低m－HJV表达，抑制肝hepcidin表达，促进肝细胞贮存铁的释放，进而维持运动中机体对铁的需求，而不至引发运动性低血色素。此外，由于hepcidin是肠铁吸收的负调节子，HIF－2主要作用于小肠［18］，因此，低氧环境下肠铁吸收的变化需做进一步研究。

4 结论

本研究从组织层面和分子生物学层面上进一步支持和完善了低氧对铁代谢的调控模型，通过HIF－1刺激TMPRSS6高表达，降低肝脏合成hepcidin，增加肝贮存铁的释放，促进铁在体内的转运，而满足运动中机体对铁的需求。因此，适度低氧会促进铁在体内的重新分布，使铁由贮存部位向循环系统释放，改善机体的铁状态，这可能是低氧预防运动性低血色素发生的原因之一。除了HIF－1，还有HIF－2可能在低氧环境中对机体铁代谢也起到重要调控作用，其机制尚需深入研究。

［1］刘树欣，王海涛，刘玉倩，等.运动性低血色素形成过程中大鼠肝脏HJV mRNA表达及血清Hepcidin含量的变化［J］.体育科学，2011，31（3）：53－56.

［2］刘玉倩，常彦忠，钱忠明，等.不同强度游泳运动大鼠不同组织铁分布及血清铁状态的影响［J］.解剖学报，2005，36（5）：518－522.

［3］刘玉倩，钱忠明，常彦忠，等.运动对铁代谢影响的研究［J］.体育科学，2004，24（1）：27－30.

［4］刘玉倩，王海涛，赵斌，等.不同强度运动对大鼠肝hepcidin mRNA表达和血清IL－6、铜蓝蛋白（CP）含量的影响［J］.体育科学，2009，29（5）：66－69.

［5］赵华，曾凡星，张漓.4周低氧运动对骨骼肌mTOR／p70～（S6K）通路的时程影响［J］.体育科学，2010，30（1）：51－61.

［6］赵杰修，田野，曹建民，等.不同运动方式对大鼠血红蛋白浓度的影响——大鼠运动性贫血模型建立方法探讨［J］.中国运动医学杂志，2004，23（4）：436－440.

［7］CHAPMAN R F，STRAY－GUNDERSEN J，LEVINE B D.Epo production at altitude in elite endurance athletes is not associated with the sea level hypoxic ventilatory response［J］.Sci Med Sport，2010，13（6）：624－629.

［8］CHASTON T B，MATAK P，POURVALI K，et al.Hypoxia inhibits hepcidin expression in HuH7hepatoma cells via decreased SMAD4signaling［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2011，300（4）：C888－895.

［9］COLLINS J F，WESSLING－RESNICK M，KNUTSON M D. Hepcidin regulation of iron transport［J］.J Nutr，2008，138（11）：2284－2288.

［10］DIDIER F，PISANI1，CLAUDE A，et al.Skeletal Muscle HIF－1 Expression Is Dependent on Muscle Fiber Type［J］.J Gen Physiol，2005，126（2）：173－178.

［11］DONOVAN A，BROWNLIE A，ZHOU Y，et al.Positional cloning of Zebraish ferroportin 1identifies a conserved vertebrate iron exporter［J］.Nature，2000，403（6771）：776－781.

［12］DU X，SHE E，GELBART T，et al.The serine protease TMPRSS6is required to sense iron deficiency［J］.Sci，2008，320（5879）：1088－1092.

［13］FLEMING R E.Iron and inflammation：cross－talk between pathways regulating hepcidin［J］.J Mol Med，2008，86（5）：491－494.

［14］JOHNSON－WIMBLEY T D，GRAHAM D Y.Diagnosis and management of iron deficiency anemia in the 21st century［J］.Therap Adv Gastroenterol，2011，4（3）：177－184.

［15］LAKHAL S，SCHÖDEL J，TOWNSEND A R，et al.Regulation of Type II Transmembrane Serine Proteinase TMPRSS6by Hypoxia－inducible Factors：new link between hypoxia signaling and iron homeostasis［J］.J Biol Chem，2011，286（6）：4090－4097.

［16］LENOIR A，DESCHEMIN JC，KAUTZ L，et al.Iron－deficiency anemia from matriptase－2inactivation is dependent on the presence of functional Bmp6［J］.Blood，2011，117（2）：647－650.

［17］LIU Y Q，CHANG Y Z，ZHAO B，et al.Does hepatic Hepcidin play an important role in exercise－associated anemia in rats？［J］.Int J Sport Nutr Ex Metab，2011，21（1）：19－26.

［18］MASTROGIANNAKI M，MATAK P，DELGA S，et al.Deletion of HIF－2αin the enterocytes decreases the severity of tissue iron loading in hepcidin knockout mice［J］.Blood，2012，119（2）：587－590.

［19］NEMETH E，TUTTLE M S，POWELSON J，et al.Hepcidin regulates iron efflux by binding to ferroportin and inducing its internalization［J］.Sci，2004，306（5704）：2090－2093.

［20］TALBOT N P，LAKHAL S，SMITH T G，et al.Regulation of hepcidin expression at high altitude［J］.Blood，2012，119（3）：857－860.

［21］TEKIN D，DURSUN AD，XI L.Hypoxia inducible factor 1（HIF－1）and cardioprotection［J］.Acta Pharmacol Sin，2010，31（9）：1085－1094.

［22］ZHANG A S，ANDERSON A，WANG J，et al.Suppression of hepatic hepcidin expression in response to acute iron deprivation is associated with an increase of matriptase－2protein［J］.Blood，2011，117（5）：1687－1699.

Effects of TMPRSS6on the Iron Metabolism of Rats in the Prevention of Exercise－Associated Anemia by Hypoxia

LIU Yu－qian1，WANG Hai－tao1，LI Hai－zhou2，WANG Yu1，SONG Wen－jing1

Objective：To illuminate effects of hypoxia on iron metabolism in the prevention of exercise－associated anemia.Methods：24male Wistar rats were randomly divided into three groups，the control group（CG），and the strenuously exercised group（EG），and the hypoxia exercise group（13.6%O2，8h／d，HE）.The content of erythropoietin（EPO）and serum Ferritin（SF）were examined by ELISA kits（Abcam）.The mRNAs of hepatic hepcidin，hypoxiainducible factor 1（HIF－1），transmembrane serine proteases 6（TMPRSS6）and hemojuvelin（m－HJV）were examined by RT－PCR.Results：1）Compared with EG，the Hb，SF，and iron storage in bone marrow of HE were significantly increased（Hb：HE：139.56±10.24g／L，EG：113.16±17.36g／L，P＜0.01；SF：HE：29.72±2.85ng／mL，EG：18.23±3.57ng／mL，P＜0.01；iron storage in bone marrow：HE：75.98±7.08μg／g，EG：62.19±8.98μg／g，P＜0.05）.2）Compared with EG，the mRNAs of HIF－1and TMPRSS6in the liver of HE were significantly increased.3）The mRNAs of HJV and Hepcidin of HE were decreased compared to EG，and the iron storage in liver was decreased in HE（HE：80.18±13.66μg／g，EG：111.51±12.64μg／g，P＜0.01）.Conclusions：Moderate hypoxia plays an important role in preventing exercise－induced iron deficiency.Exposure to hypoxia，the increased HIF－1 in liver stimulates the expression of TMPRSS6，and as a result，the synthesis of Hepcidin is decreased，which leads to the iron mobilization in liver to meet the requirement of iron during strenuous exercise，which prevents the exercise－associated anemia.

TMPRSS6；hypoxia，exercise－associated anemia；rat；animal experiment

G804.7

1000－677X（2012）10－0069－04

2012－07－29；

2012－09－17

国家自然科学基金资助项目（30700390）；河北省自然科学基金资助项目（C2009000291）；河北师范大学基金项目（L2011Y10）。

刘玉倩（1973－），女，河北保定人，教授，博士，硕士研究生导师，研究方向为运动与铁代谢的分子生物学机制，E－mail：yuqianht＠126.com；王海涛（1973－），男，河北廊坊人，副教授，博士，硕士研究生导师，研究方向为运动与铁代谢的分子生物学机制，E－mail：haitaoyq＠126.com。

1.河北师范大学体育学院，河北石家庄050024；2.河北廊坊师范学院，河北廊坊065000

1.Department of Physical Education，Hebei Normal University，Shijiazhuang 050024，China；2.Langfang Teachers′College，Langfang 065000，China.