杉木嫁接产生无性杂种的一个例证

齐 明，何贵平，罗修宝，华朝晖，翁春媚

(1.中国林业科学研究院 亚热带林业研究所，浙江 富阳 311400；2. 浙江省遂昌县林业技术推广总站，浙江 遂昌323300)

杉木嫁接产生无性杂种的一个例证

齐 明1，何贵平1，罗修宝2，华朝晖2，翁春媚2

(1.中国林业科学研究院 亚热带林业研究所，浙江 富阳 311400；2. 浙江省遂昌县林业技术推广总站，浙江 遂昌323300)

浙江省遂昌县杉木双系种子园七小区1339嫁接无性系，其穗条来源于浙江省余杭长乐杉木种子园。针对双七区1339无性系的众多接株个体间变异明显，以其余杭长乐杉木种子园中的1339正常株作对照，分析两者在形态、花期、花量和等位酶等特性上的差异性和相似性。结果证明：异常1339植株应为无性杂种。由此得到一些启示：(1)采用分子标记技术，构建种子园无性系的指纹图谱时，将相差1-2条谱带的材料划分为两个无性系时，要特别小心；因为这样做可能是错的。(2)在林木种子园、采穗圃或基因库建立时，最好采用同一无性系材料来做砧木；在困难条件下，用同一家系苗来作砧木也行，这可保证穗条接受相同的遗传因子影响。(3)对林木嫁接种子园中不同无性系的生长量，开花结实量等特性的评估时，应考虑到无性杂交这一因素造成的影响，因为不同砧木的遗传背景不同，产生的影响也会不同。

杉木；嫁接；无性杂交；无性杂种；例证；启示

数量遗传学告诉我们：任何一个性状的表型都是基因与环境共同作用的结果，即一个性状的表型值=遗传因子+环境因子+遗传因子×环境因子互作综合作用的结果。分子遗传学告诉我们：表型性状是由基因支配的，DNA是基因的遗传物质，并携带遗传信息，基因是遗传信息的物理单位和功能单位。但是基因的表达与否是由环境因子决定的，即环境因子可开启或关闭基因的表达，而基因表达又会影响有机体的内环境，同时同一基因型，在不同的(外、内)环境中，可能会出现不同的表型。由此可见，在性状的遗传变异方面，数量遗传学与分子遗传学的原理是一致的。长期以来学术界有关控制性状遗传变异的物质基础的争论，最终以“米丘林学派”的失败，以“摩尔根学派”取得了胜利而告结束。

但是作为一个有良知的科学工作者，应以追求真理为自己的终身职责。不少人认为米丘林学说中有些学术思想是正确的，对于这些正确的观点应该放在一正确的位置。例如：在园艺作物中无性杂交是普遍存在的，在不少园艺学家，至今将其作为一种重要的育种手段，并取得巨大成绩[1-6]。但在用材林的遗传育种中，无性杂交现象尚引起人们的注意。在此报道一例杉木嫁接种子园中存在无性杂交的事实，以期引起同行们的的注意，更好地为林木有性育种服务。

嫁接又叫无性杂交，是将甲植株(穗条)嫁接到乙植株(砧木)上，植物进行嫁接时，由于砧木和接穗流质的相互影响，可以产生无性杂种。因嫁接能使穗条(或砧木)的遗传特性发生改变，因此无性杂交是改变有机体遗传性的极有效的方法[3]，人们或利用砧木对接穗的影响；或利用接穗对砧木的影响来选育无性杂种。来自维普和万方网站的信息，时至目前，我国已在园艺作物、经济作物以及疏菜作物中，无性杂交育种取得了巨大成绩，培育出了不少优品种。但是在林木遗传育种中，无性杂交(即嫁接)会产生无性杂种这一现象尚未引起育种工作者的注意，因为无性杂交不利于种子园、基因库、采穗圃中优良品种遗传特性的保持与稳定。

时至目前，国内以自根苗为参照对象，对无性杂交苗进行了多方面的研究：研究砧木或穗条对无性杂种的影响，从形态、生长、结实、生化特性，根系生长与分布、根际微生物种群变化等方面的相互影响，无性杂种优势产生的机制，到杂种的化学生态学研究等[8-25]， 目前现代分子生物学的研究则揭示出：参与嫁接的砧木与穗条间存在基因相互交流，从而使穗条(或砧木)的遗传性发生一定的改变，正是这种相互影响改变了原株的遗传特性[5-6]。由于在林木中仍在广泛地采用嫁接技术，杉木造林用种大部分来自嫁接种子园，种子园中会发生无性杂交，其影响应引起人们的注意。本研究报道了杉木嫁接种子园中，无性杂交产生无性杂种的事实，以期为林木育种服务。

1 材料与方法

1.1 研究材料

研究材料是浙江遂昌县嫁接双系种子园第七区的建园材料，该双系种子园的两个无性系是1339和1366，穗条均来自浙江省余杭长乐林场初级嫁接种子园。遂昌双系种子园中接株采用嫁接方法来完成，目前早以投产。由于不同砧木的遗传背景不同，嫁接后1339无性系部分接株(约45%)在若干特性上，彼此产生了明显的变异，这使人怀疑是嫁接时穗条搞错了。齐明等人不同意这一观点，因为穗条错用不可能有如此大的比率。故展开了如下研究，以正常株为对照进行对比研究，论证变异株即为无性杂种。

1.2 研究方法

(1)以1339正常接株为参比对象，研究正常1339与变异1339在若干形态习性方面的差异大小；(2)以1339正常接株为参比对象，研究正常1339与变异1339在开花结实习性方面的差异大小；(3)以1339正常接株为参比对象，两种类型1339，各取数粒发芽种子的胚或胚乳/胚，采用PAGE等位酶技术，研究正常1339与变异1339，在苹果酸脱氢酶(MDH,EC.1.1.1.37); 苹果酸酶(ME,E.C.1.1.1.40);谷氨酸草酰乙酸转氨酶(GOT,EC.2.6.1.1);甲酸脱氢酶(FDH,EC.1.2.1.2)和乳酸脱氢酶(LDH，E.C.1.1.1.27)5种等位酶方面的差异性和相似性。

2 结果与分析

2.1 正常1339接株与变异1339接株在若干形态习性方面的差异大小

通过对余杭长乐林场杉木初级种子园中的1339无性系的观察分析，指定双七区中一种类型1339为正常接株，另一类的1339接株为变异株，整个双七区中1339大约45%的接株产生了明显的变异。

在形态方面，正常的1339接株叶色为青枝杉，侧枝分枝略稀而粗；而变异的1339接株枝叶虽亦为青枝杉，但分枝细密。

2.2 正常1339接株与变异1339接株在开花结实习性方面方面的差异大小

通过对遂昌杉木双系种子园七区中的无性系进行花期观察分析时，发现双系种子园中的1339无性系正常株与变异株亦存在明显的变异。它们从球果大小、多少、花期早晚等方面，都存在着明显的差异：

在开花结实习性方面，正常的1339接株的雌花数量中等多少，但球果较大，其雄花略偏多，雌雄球的开花期也较变异株1339接株早；而变异株1339接株，雌球花细且多，明显偏雌，集中成簇，雄花开放较正常1339晚。

2.3 两类植株在等位酶方面方面的差异性和相似性

以上描述了正常的1339接株和变异1339接株,在形态及开花结实方面存在明显的差异,下面论述其等位酶分析的结果。采用PAGE同工酶技术，对正常的1339接株和变异1339接株进行基因型分析，先经过预备试验，从在20个酶系统中，筛选出5种等位酶系统。它们是苹果酸脱氢酶(MDH,EC.1.1.1.37); 苹 果 酸 酶 (ME,E.C.1.1.1.40)；谷氨酸草酰乙酸转氨酶(GOT,EC.2.6.1.1);甲酸脱氢酶(FDH,EC.1.2.1.2)和乳酸脱氢酶(LDH，E.C.1.1.1.27)。经同工酶实验，发现1339无性系两种类型，在苹果酸脱氢酶(MDH,EC.1.1.1.37); 苹果酸酶(ME,E.C.1.1.1.40)；甲酸脱氢酶(FDH,EC.1.2.1.2)和乳酸脱氢酶(LDH，E.C.1.1.1.27) ， 4种酶系统上，它们的图谱完全一致，即在这4种酶系统上，两种类型的1339具有相同的遗传结构。仅在谷氨酸草酰乙酸转氨酶系统上，两者存在明显的差异：正常接株1339胚的GOT的分析结果是，3个等位酶位点只有一个位点(GOT-1)是杂合的，另外两个位点(GOT-2/GOT-3)是纯合的；而变异株1339胚乳/胚GOT的分析结果是，三个等位酶位点却有2个位点(GOT-1/GOT-2)是杂合，仅GOT-3是纯合的，再用发芽种子，重复一次GOT同工酶实验，获得的结果与上次分析结果完全相同。为了节约篇幅，突出重点，PAGE等位酶的图谱，仅提供谷氨酸草酰乙酸转氨酶(GOT,EC.2.6.1.1)的实验结果，见图1、2。

图1 正常1339无性系11粒胚乳GOT电泳示意(GOT是2个等位基因编码的二聚体)Fig.1 Got electrophoresis diagram of nomoral 1339 clone at embryos (Got is dimmer encoding by 2 alleles)

图2 变异株1339无性系6粒胚乳/胚GOT电泳(GOT是2个等位基因编码的二聚体)Fig. 2 Electrophoretogram of six endosperm and embryo dimmers of grafting clone 1339’s variant

3 结论与讨论

3.1 结果分析与讨论

正常的1339接株和变异1339接株,在形态及开花结实方面存在明显的差异,是乎是两个无性系，但是等位酶的分析结果，则反应正常的1339接株和变异1339接株在遗传结构上差异很小，两者具有很大的相似性，因此这种变异接株应为1339的无性杂种。

这里须说明的是，其一，两类1339中还存在微变异，如针叶的坚挺或柔软等等；其二嫁接也使其它无性系的接穗产生了变异，如双七区另一无性系1366中，也有一小小部分接株在针叶形态(气孔线明显否)，雄花体积大小和数量的多少等方面产生的变异,因1366无性杂种发生比率太低(目测约1%)，故本研究仅对1339无性杂交的情形展开分析研究。

关于遂昌县双系种子园中1339产生变异接株这一现象，以前生理学的研究认为，砧木向接穗转移了诸如促进细胞分裂素类等物质，从而促进了接穗的枝叶等性状的细胞分裂；同样接穗也会向砧木转移了诸如生长素等物质，从而促进了根系性状性的生长。现代分子遗传学的研究结果表明，在植物嫁接植株中，砧木与接穗间进行了基因交流。在遂昌双系种子园中，有些1339的穗条与砧木发生了无性杂交，那种变异株即为无性杂种。

以上研究表明，在林木中嫁接使接穗与砧木间可能发生无性杂交。但从杉木大量的嫁接试验结果看来，无性杂交发生频率较低，无性杂种优势的方向具有不确定性，无法预测。采用有性杂交的方式来选育新品种仍是首选的育种方法。

3.2 结 论

通过以上观察分析，发现1339正常株与异常株在表型上存在较大的差异，但是同工酶分析的结果，揭示出其基因型的遗传结构还是比较相近的。因为5个酶系统中，仅GOT三个位点中的一个位点由纯合变成了杂合。这符合无性杂交的原理。

杉木嫁接可以产生无性杂种,这对有性育种会产生许多影响,并给我们带来许多启示:

(1)采用分子分子标记技术，构建无性系的指纹图谱时，将种子园中差异相差1-2条谱带的材料划分为两个无性系时，要特别小心；因为这样做可能是错的。

(2)在林木种子园、采穗圃或基因库建立时，最好采用同一无性系材料来做砧木，在困难条件下，用同一家系苗来作砧木也行，这可保持穗条接受相同砧木遗传因子的影响。

(3)由于在杉木中存在无性杂交的产物，无性杂交产生的杂种，其后果具有的随机性和不可预测性，因此在杉木中无性杂交对杉木的良种选育一时没有指导作用。

(4)对林木嫁接种子园中不同无性系的生长量，结实量等特性的评估时，应考虑到无性杂交这一因素造成的影响，因为不同砧木的遗传背景不同。

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An asexual hybrid generating from Chinese fir grafting clones in Suichang of Zhejiang province

QI ming1, HE Gui-ping1, LUO Xiu-bao2, HUA Chao-hui2, WENG Chun-mei2
(1. Subtropical Forestry Institute, Chinese Academy of Forestry, Fuyang311400, China 2. Suichang Forestry Bureau of Zhejiang, Suichang 323300, China )

The grafting clone 1339 grew in the seventh plot of biclonal seed orchard in Suichang County of the Zhejiang province,their cuttings were taken from the Changle Chinese fir seed orchard in Yuhang,and there were distinct variables among the individuals.Compared the grafted clone 1339 in Suichang orchard with the clone 1339 in the Changle orchard, it was found that there were obvious diversity and similarity in aspects of morphology,flowering period,flower amount and allozyme between the two clones. The results confirm that the grafted clone 1339 having eхceptionally characteristics should be a kind of aseхual hybrid. Furthermore, we can get some implications: (1) when using the molecular marker technique, constructiog clone fingerprint, and dividing materials with the difference of 1-2 bands into two clones, we must be specially careful, because this result possibly a wrong outcome. (2) when establishing, tree graft seed orchard, cutting orchard or gene bank, we should better use the identical clone material to make the stock;under the difficult condition, maybe makes same family seedling use stocks .This may maintain cutting-strips to accept the same genetic influence. (3) when evaluating the growth quantity, flowering and seed-bearing yield of different grafting clones, the influence of aseхual hybridization on cutting-strips should be considered because the stocks are different sources, the different stock’s genetic background will produce different genetic effects.

Chinese fir;graft; aseхual hybridization; vegetative hybrid; eхemplification;enlightenment

2011-04-14

浙江省林业厅与中国林科院合作项目”杉木高世代育种群体建立和优质速生新品种选育(2007SY09)；浙江省科技厅重大项目“优质珍贵用材树种新品种创制及高效培育关键技术研究与示范(2008C2004-2)

齐 明(1962—)，男，湖北省武汉人，副研究员，从事林木多性状遗传改良研究；E-mail: Qiwater03@sina.com

S791.27

A

1673-923X(2012)02-0056-04

[本文编校:文凤鸣]