宽苞十大功劳提取物抑菌活性的初步研究

欧阳蒲月，朱翠霞，陈功锡，莫端峰

宽苞十大功劳提取物抑菌活性的初步研究

欧阳蒲月1,2，朱翠霞1，陈功锡2，莫端峰2

（1.广东食品药品职业学院，广东广州 510520； 2.吉首大学 植物资源保护与利用湖南省高校重点实验室，湖南吉首416000）

对民间药用植物宽苞十大功劳Mahonia eurybracteata Fedde提取物的抑菌活性物质进行研究，结果表明：(1)通过对不同部位提取物所进行的抑菌试验，发现叶和茎均含有有抑菌活性物质，但茎的抑菌效果更强更明显。(2)对超声提取和索氏提取二个方法进行比较，发现索氏提取物抑菌效果与超声提取抑菌效果只存在较小的差异。(3)宽苞十大功劳提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌、藤黄球菌、黑曲霉、白色念珠菌的最低抑菌浓度分别为0.6 g/mL、2.0 g/mL、1.0 g/mL、0.8 g/mL、2.0 g/mL、0.6 g/mL；但黑曲霉最小杀菌浓度为4 g/mL外，其它菌的最小杀菌浓度均为2 g/mL。(4)不同溶剂提取物中，65%乙醇溶液提取物具有最佳抑菌效果。不同极性溶剂的抑菌试验表明，抑菌活性物质易溶于石油醚、乙醚等非极性溶剂。这些结果为开发新型、安全、高效的临床药物提供依据，也为扩大药源提供科学依据。

宽苞十大功劳；提取物；抑菌活性；不同溶剂；索氏提取；超声提取

中国药典注明功劳木为小檗科植物阔叶十大功劳和细叶十大功劳(狭叶十大功劳)的茎入药，其有清热燥湿、泻火解毒之功效。现代研究证明具有抗菌、消炎、镇痛等多种生理活性。其有效成分为小檗碱、药根碱等多种生物碱，但各种成分的比例随植物种不同而异，因而功效也不尽相同[1]。

宽苞十大功劳Mahonia eurybracteata Fedde属于小檗科Berberidaceae十大功劳属Mahonia，产于贵州、四川、湖北、湖南、广西。生于常绿阔叶林中、竹林中、灌丛中、林缘、草坡或向阳岩坡。海拔350～1 950 m。为《贵州省中药材、民族药材质量标准》收载品种。以根入药，具有清肺热、泻火的功效[2]。有研究表明宽苞十大功劳含有小檗碱、巴马亭、药根碱、 黄连碱、尖刺碱、非洲防己碱、巴芦奇碱等物质[3-6]。十大功劳属植物的化学成分主要是生物碱类[7]，具有抗菌、消炎、抗病毒、抗癌[8-10]、抗心率失常、降血糖、抗血小板聚集、松弛平滑肌等作用，而且冬青叶十大功劳的茎的提取物治疗牛皮癣疗效确切，受到国内外广泛的关注。

宽苞十大功劳资源丰富,目前尚仅有对其所含有的生物碱及非生物碱类等化学成分方面进行了研究同[11-12]。本文对宽苞十大功劳的抑菌活性进行初步研究，为宽苞十大功劳的传统药用价值以及后续研究建立科学根据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材 料

于湘西自治州吉首市又一村鲜采宽苞十大功劳地上部分，由吉首大学陈功锡教授鉴定为宽苞十大功劳Mahonia eurybracteata Fedde。将其室温阴干，将叶与茎分离，65 ℃烘干，分别粉碎过100目筛。

试验用菌均购自湖南省疾病预防控制中心，分别为：金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、大肠杆菌Escheichia coli、枯草杆菌Bacillus subtilis、藤黄球菌Micrococcus luteus、黑曲霉Aspergillus niger、白色念珠菌Monilia albicans。细菌在37 ℃培养24 h以试管斜面培养基保存，真菌在29 ℃培养72 h，转接到培养皿中，分别存以备用。

1.1.2 主要仪器

旋转蒸发仪(RE540 Yamato)、pH计(HM-205TOA)、冷冻干燥机(FD-1)、培养箱(PW/10-002)、超净工作台(CCV-1311)、高压蒸汽灭菌器(SM-52)、分析天平(AEG-220)、索氏提取器。

1.1.3 主要试剂

95%乙醇、无水甲醇、石油醚、乙醚、浓盐酸、硼酸、氨水、NaOH、琼脂、牛肉膏、蛋白胨，均为国产分析纯试剂。市售黄连素（四川亚宝光泰药业有限公司）。

1.2 方 法

1.2.1 抑菌活性物质的提取与分离

1.2.1.1 不同部位提取物：取不同部位材料5 g，加入65%乙醇溶液100 mL，先超声提取30 min，然后45 ℃水浴30 min，趁热过滤，浓缩至5 mL，使生药浓度为1 g/mL。

1.2.1.2 不同溶剂提取物：取试验1.2.1.1中抑菌效果最强部位材料5 g，分别用蒸馏水、甲醇、65%乙醇、95%乙醇作溶剂，按上述方法提取。

1.2.1.3 不同提取方法：超声提取如1.2.1.1。索氏提取方法如下：取试验1.2.1.1中抑菌效果最强部位材料5 g，装入索氏提取器的滤纸套筒中，加入100 mL95%乙醇萃取液，加沸石数粒，于80℃水浴加热，水浴回流提取4 h，提取完毕，提取液经旋转蒸发至近5 mL，定容至5 mL。

1.2.1.4 不同溶剂萃取物：称取试验1.2.1.1中抑菌活性最强的部位50 g，加入试验1.2.1(2)最佳提取溶液500 mL，按上述方法提取，重复1次，合并滤液，浓缩至50 mL，使生药浓度为1 g/mL。滤液依次用石油醚、乙醚进行萃取（每次加有机溶剂50 mL，混匀，静置30 min，取上层液，下层液再用以上萃取液重复萃取两次，合并萃取液），得到石油醚萃取物A、乙醚萃取物B，浓缩萃取物，回收溶剂，萃取物以甲醇定容至50 mL，使生药浓度为1 g/mL。

1.2.2 抑菌（细菌）活性测定

1.2.2.1 含药滤纸片准备：用打孔器将定性滤纸打成直径为5 mm的小圆片，置培养皿内高压灭菌后，分别浸泡在不同供试药液中，备用。阴性对照浸泡无菌水，阳性对照浸泡黄连素溶液。

1.2.2.2 接种： 用竹签挑取细菌放入无菌水成稀释菌液，用移液器吸取120 μL稀释菌液滴在直径为9 cm的营养琼脂平皿中央，用玻璃刮铲将菌液均匀地涂布于整个平板上，于培养箱内倒置培养10～15 min至培养基表面干燥后， 分别将含药滤纸片均匀地放置在接种了不同受试菌的培养基表面，每皿放4片含药滤纸片，稍加按压使之紧贴培养基。37 ℃培养箱内培养24 h后，取出平板，测量各纸片周围抑菌圈直径。

1.2.3 含毒介质法抑菌(真菌) 活性测定

1.2.3.1 含毒培养基的制备：在无菌条件下，取提取液5 mL，10 mL 2个梯度加入25 mL50 ℃左右的培养基中，得到相应的含提取液的培养基，充分振荡混匀后倒入直径9 cm的培养皿中，每浓度为2个重复，每菌株抑菌试验重复2次，对照培养基为空白培养基，即不加任何提取液，只加相应体积的无菌水。

1.2.3.2 接种培养：取培养基上生长5～7 d（菌丝均匀布满培养基表面）的供试菌种，用直径为5 mm的无菌玻璃管在菌落边缘切取带菌培养基（菌饼），用接种针将菌饼分别接种至冷却后的含毒培养基和对照培养基中，每个平皿接种菌饼1块，置28 ℃的生化培养箱内培养3至4 d，待对照组培养皿中的菌丝体充分生长后（孢子不成熟），测量处理组和对照组菌落直径，计算各处理浓度对菌体生长速率的抑制百分率。

1.2.3.3 抑菌作用计算方法：按十字交叉法测量菌落直径2次，取其平均值为菌落的大小，提取液的抑菌百分率按下式计算：抑制率(%)＝（对照组菌落的平均直径－处理组菌落的平均直径）/对照组菌落的平均直径×100%。

1.2.4 最小抑菌浓度(MIC)与最小杀菌浓度(MBC)测定

取试验1.2.1中抑菌效果最佳萃取物稀释成含生药浓度 4.0、2.0、1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.05 g/mL的试液，取药液0.1 mL加入到盛有0.8 mL的液体培养基中，接入0.1 mL的菌悬液，摇匀，置37 ℃摇床(200 r/min)培养24 h。若液体培养基完全清亮，表示无细菌生长，无细菌生长的最小浓度为最小抑菌浓度。另设未加菌液为空白对照、黄连素作阳性对照。

将无细菌生长的液体培养基中取出0.1 mL涂布平板，置37 ℃温箱中培养24 h观察有无细菌生长。无细菌生长的最小浓度为最小杀菌浓度。

2 结果与分析

2.1 不同部位的抑菌活性

实验结果（表1、表2、表3）表明，宽苞十大功劳的叶与茎对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、藤黄球菌、白色念珠菌均有一定的抑制作用，对大肠杆菌、黑曲霉的抑制作用均较弱，但茎提取物较叶提取物抑菌效果强。

表1 宽苞十大功劳不同部位提取物对抑菌活性的影响比较(65%乙醇)†Table 1 Comparision of antibacterial activity to the extracts from different part of Mahonia eurybracteata (65%alcohol)

表2 宽苞十大功劳不同部位提取物对抑菌活性的影响比较(95%乙醇)Table 2 Comparision of antibacterial activity to the extracts from different part of Mahonia eurybracteata (95%alcohol)

表3 宽苞十大功劳不同器官部位提取物对抑菌活性的影响比较(真菌)†Table 3 Comparision of antibacterial activity to the extracts from different part of Mahonia eurybracteata Fedde (fungus)

2.2 不同溶剂提取物的抑菌活性

不同溶剂提取宽苞十大功劳的茎粉末所得到的提取物抑菌试验（表4、5）表明，65%乙醇的提取物对各菌的抑制效果最强；无水甲醇的提物次之；95%乙醇的提物再次之；蒸馏水的最弱。由此推测，宽苞十大功劳的抑菌活性物质可能具有表面活性，醇浓度太高或者用蒸馏水(不含有醇类基团)都不利于其溶解释出。

表4 不同溶剂提取宽苞十大功劳的提取物对抑菌活性的影响比较（细菌）Table 4 Comparision of antibacterial activity to the extracts from Mahonia eurybracteata in different solvent (viruses)

表5 不同溶剂提取宽苞十大功劳的提取物对抑菌活性的影响比较（真菌）Table 5 Comparision of antibacterial activity to the extracts from Mahonia eurybracteata in different solvent (fungus)

2.3 不同提取方法对宽苞十大功劳抑菌活性的影响

从结果（表6、表7）发现，索氏提取与超声提取所得到的提取抑菌效果只存在很小的差异。

表6 不同提取方法对提取宽苞十大功劳抑菌活性的影响比较Table 6 Effect of acid and alkali on the antibacterial activity to the extracts from Mahonia eurybracteata e(viruses)

表7 不同提取方法对提取宽苞十大功劳抑菌活性的影响比较（真菌）Table 7 Effect of acid and alkali on the antibacterial activity to the extracts from Mahonia eurybracteata (fungus)

2.4 不同溶剂萃取物的抑菌活性

除对大肠杆菌抑菌效果较弱外，乙醚萃取物对5种菌的抑制效果均好，远大于阳性对照黄连素；石油醚萃取物对5种菌也有一定抑制效果；萃余物对各菌均无抑制效果（表8、表9）。表明宽苞十大功劳的抑菌活性物质易溶于非极性溶剂。乙醚对减弱抑菌活性的贡献最大，石油醚次之，这两种溶剂能够将抑菌活性物质萃取完全，因此成分提取时应选用这类非极性溶剂。

表8 不同极性溶剂萃取宽苞十大功劳的提取物抑菌活性的比较(细菌)Table 8 Comparision of antibacterial activity to the extracts from Mahonia eurybracteata extracted in different nonpolar solvent(viruses)

2.5 最小抑菌浓度(MIC)及最小杀菌浓度(MBC)

宽苞十大功劳提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌、藤黄球菌、黑曲霉、白色念珠菌的最低抑菌浓度分别为0.6 g/mL、2.0 g/mL、1.0 g/mL、0.8 g/mL、2.0 g/mL、0.6 g/mL；但黑曲霉最小杀菌浓度为4.0 g/mL外，其它菌的最小杀菌浓度均为2.0 g/mL（表10、表11）。

表9 不同极性溶剂萃取宽苞十大功劳的提取物抑菌活性的比较（真菌）Table 9 Comparision of antibacterial activity to the extracts from Mahonia eurybracteata extracted in different nonpolar solvent (fungus)

表10 最小抑菌浓度测定†Table 10 MIC test of ethereal extract

表11 最小杀菌浓度测定†Table 11 MBC test of ethereal extract

3 讨 论

本研究对宽苞十大功劳的叶和茎等不同部位的65%乙醇、95%乙醇提取物进行了抑菌试验，筛选更有效抑菌部位，并进一步用不同溶剂对有效抑菌部分进行抑菌成分的提取和萃取，用不同提取方法得到的提取物对比抑菌效果的不同，最后再用不同的溶剂萃取提取物对比抑菌效果的不同。结果发现：（1）宽苞十大功劳的抑菌活性物质存在于叶和茎中，但茎提取物的抑菌活性更强；这也很好的解释了为什么在民间，其以茎木入药为主且其药材称为功劳木。（2）华南十大功劳的65%乙醇溶液提取物具有最高的抑菌活性，说明华南十大功劳的化学成分中含有极性物质，但它的抑菌活性物质可能具有表面活性，醇浓度太高或者用蒸馏水(不含有醇类基团)都不利于其溶解释出。对5种所试菌株的敏感性由强到弱依次为：金葡菌>藤黄球菌>枯草杆菌>大肠杆菌>白色念珠菌>黑曲霉。实验结果与对同属植物阔叶十大功劳的抑菌作用[13]、小檗碱抑菌[14]、巴马汀抑菌[15]相似。还有研究发现冬青叶十大功劳中分离得到的小檗碱对大肠杆菌、草杆菌、金黄色葡萄球菌等17种细菌也具有抑制作用[16]，且相关菌的敏感性由强到弱位次是；金葡菌>大肠杆菌>枯草杆菌>白色念珠菌>黑曲霉。这与我们实验的结果也是相似的。（3）对超声提取和索氏提取二个方法进行比较，发现索氏提取物抑菌效果与超声提取抑物菌效果只存在较小的差异。说明抑菌活性物质的提取与提取时间及与溶剂相互接触时间的影响不是很大。但索氏提取物对黑曲霉不抑菌，说明索氏提取环境不利于提取抑制黑曲霉的化学成分。（4）提取物中的抑菌活性成分易溶于乙醚等非极性溶剂中，说明其化学成分除了有极性成分外，还有我们不知道的非极性成分。因此还需要下一步对其进行化学成分的分离与鉴定，为临床用药开发新型、安全、高效的药物提供依据，也为扩大药源提供科学依据。

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Preliminary research of antimicrobial activity of extract from Mahonia eurybracteata Fedde

OUYANG Pu-yue1,2, ZHU Cui-xia1, CHEN Gong-xi2, MO Duan-feng2
(1.Guangdong Food and Grug Vocational College, Guangzhou 510520, Guangdong, China;2.Key Laboratory of Plant Resource Conservation and Utilization, Jishou University, Jishou 416000, Hunan, China)

The bacteriostatic test of extract from Mahonia eurybracteata Fedde, one of medical plants was carried out, the results are as followings.(1) The antibacterial substance existed in the stems and leaves, and leaves’s extract was more sensitive.(2) Comparing the bacteriostatic test from the extracting methods of Ultrasonic and Soxhlet, it was found that there was little difference on the two different methods.(3) The minimal inhibitory concentration of the extract on Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus subtilis，Micrococcus luteus，Aspergillus niger，Monilia albicans were 0.6, 2.0, 1.0, 0.8, 2.0, 0.6, 1.0 g/mL respectively; the minimal bactericidal concentration all were 2 g/mL expect Aspergillus niger was 4 g/mL.(4) In order to get the extract that has the optimum antibacterial effect, the solvent should be 65% alcohol.The bacteriostatic test by different polar solvent shows that the antibacterial substancy easily dissolved in non-polar solvent such as petroleum ether, ethyl ether.The bacteriostatic test of extract from Mahonia eurybracteata Fedde provides the basis for new and safety and high efficiency clinical application.

Mahonia eurybracteata Fedde; extract; antimicrobial activity; different solvent; Soxhlet extraction ; ultrasonic extraction

S789.9

A

1673-923X(2012)03-0166-05

2011-10-19

植物资源保护与利用湖南省高校重点实验室开放项目(JZ200906)；南药资源保护与利用工程技术开发中心建设项目（GCZX-B0905）

欧阳蒲月(1978—)，女，湖南邵阳人，讲师，硕士，从事药用植物学的教学与研究工作；E-mail：ouyangpy@gdyzy.edu.cn

陈功锡(1966—)，男，湖南桑植人，教授，电话：15874639263；E-mail： chengx@jsu.edu.cn

[本文编校：吴 毅]