啤酒废酵母中RNA和β-（1，3）-D-葡聚糖的综合提取

王志宏，邢沈阳，张桂荣

（1.长春中医药大学基础医学院，吉林 长春 130117；

2.吉林大学畜牧兽医学院，吉林 长春 130062；

3.吉林大学生命科学学院，吉林 长春 130012）

啤酒废酵母中RNA和β-（1，3）-D-葡聚糖的综合提取

王志宏1，邢沈阳2，张桂荣3

（1.长春中医药大学基础医学院，吉林 长春 130117；

2.吉林大学畜牧兽医学院，吉林 长春 130062；

3.吉林大学生命科学学院，吉林 长春 130012）

为实现RNA和β-（1，3）-D-葡聚糖的综合提取，通过碱－酶提取法和优化稀碱提取条件，研究了温度、NaOH质量分数对RNA提取的影响.结果表明：温度为100℃，NaOH质量分数为4%时，提取率为7.65%，纯度为70.24%.进一步比较中性蛋白酶和碱性蛋白酶对β-（1，3）-D-葡聚糖提取的影响，发现中性蛋白酶得到的产物较多，纯度较高.实验结果为进一步的工业化生产奠定了基础.

啤酒废酵母；RNA；β-（1，3）-D-葡聚糖；碱－酶提取法

啤酒废酵母为啤酒生产的主要废弃物，它含有丰富的蛋白质、核酸、维生素、矿物质等多种高营养、高附加值的组分，且安全、无毒，利用价值非常高.而目前啤酒酵母的主要处理方式是干燥后作为饲料或直接排放，有效成分并没有得到充分的利用.

免疫核糖核酸（immunogenic RNA）是动物体内一种具有转移免疫性功能的生物大分子，是一种重要的免疫触发剂或免疫调节剂，广泛应用于医药与食品行业.β-（1，3）-D-葡聚糖是一种极富生物活性的免疫多糖，目前已证实它对肿瘤、肝炎、糖尿病、心血管疾病、高血脂等疑难病都有良好的治疗效果.

随着啤酒等发酵行业的快速发展，大量的发酵副产物随之产生，如何利用这些低值的副产物，做到既不污染环境，又能产生良好的经济效益，一直是研究的热点.本研究利用碱－酶提取法，进行了从啤酒废酵母中提取RNA 和β-（1，3）-D-葡聚糖的综合实验，以得到较高纯度的RNA和β-（1，3）-D-葡聚糖，为实现低成本的工业化生产奠定基础［1－5］.

1 材料和方法

1.1 主要试剂

啤酒酵母干粉，日本WAKO酵母RNA标准样，中性蛋白酶和碱性蛋白酶（北京奥博星生物技术有限责任公司生产）；其他试剂均为国产分析纯.

1.2 RNA的提取及影响因素

1.2.1 RNA标准曲线的制定

准确称取10.0mg RNA，用少量0.05mol／L NaOH湿透，然后用玻璃棒研磨成糊状的混浊液，加入少量蒸馏水，混匀，调pH＝7.0，再用蒸馏水定容至10mL.此溶液即为标准RNA母液（1mg／mL）.

取母液1.0mL置10mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，此溶液为100μg／mL的标准RNA溶液.

取6支干净烘干的试管，按表1的编号及配置加入试剂，然后置沸水中加热25min，取出冷却，以0号管作对照，于670nm波长处测定吸光度值，取两管平均值.以RNA浓度为横坐标、吸光度值为纵坐标作图，绘制标准曲线.

表1 RNA标准品的配置

1.2.2 啤酒酵母中RNA的提取

准确称取10g干燥酵母粉，加入100mL水充分洗涤，4 800r／min离心10min；将沉淀物重复洗涤、离心至洗涤液澄清为止.

将上述沉淀放入100mL烧杯中，水洗两次，离心后向沉淀物质中加入4%NaOH 30mL，然后放入沸水中水浴1h.将上述提取液取出，冷却，以4 000r／min离心10min，取上清液，倒入烧杯中，调pH＝5.5.然后边搅拌边缓慢加入150mL 95%的乙醇，以4 000r／min离心10min，弃去上清液，用少量95%乙醇洗涤3次，常温下干燥，得RNA产品.测量检测后密封放入4℃冰箱保存［6－8］.

1.2.3 温度对RNA提取的影响

分别准确称取10g干燥酵母粉，如前述在啤酒酵母中提取RNA的方法，分别在80℃，85℃，90℃，95℃，100℃的条件下提取1h，得到5种RNA粗制品.称量自制的5种干燥RNA粗制品各10mg（纯度约为50%），控制RNA的浓度在10～100μg／mL范围内，按标准RNA溶液方法配制10mL，如前述进行RNA含量的测定.

1.2.4 NaOH质量分数对RNA提取的影响

分别准确称取10g干燥酵母粉，如前述提取RNA的方法，用质量分数分别为2%，4%，6%，8%的NaOH溶液，100℃提取1h，得到4种RNA粗制品.称量自制的4种干燥RNA粗制品各10mg（纯度约为50%），控制RNA的浓度在10～100μg／mL范围内，按标准RNA溶液方法配制10mL，进行RNA含量测定.

1.3 β-（1，3）-D-葡聚糖的提取与含量测定

1.3.1 葡萄糖标准曲线的制定

苯酚－硫酸法标准曲线的制作：分别吸取40μg／mL的葡萄糖溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8，2.0mL，加去离子水补足2mL.然后加入6%苯酚1.0mL及浓硫酸5mL，静止10min，摇匀，室温放置20min后于490nm测定吸光度.以标准糖溶液的量（mL）为横坐标、吸光度值为纵坐标绘制标准曲线.

1.3.2 β-（1，3）-D-葡聚糖的提取

将提取RNA后的沉淀物质按照15mL∶1g的比例加入3%的NaOH溶液，在80℃水浴条件下水解2h，离心.将沉淀物质洗涤后加入100mL去离子水，并分成两份.调节1号样品pH＝8，加入碱性蛋白酶500μL，70℃下水解24h；调节2号样品pH＝7，加入中性蛋白酶0.019g，40℃水解24h.离心，沉淀物质用无水乙醇洗涤、干燥［9－13］.

1.3.3 β-（1，3）-D-葡聚糖含量的测定

称取β-（1，3）-D-葡聚糖提取样品4mg，放入50mL的具塞刻度试管中，加入10mol／L的硫酸溶液5mL，水解25min后，将硫酸稀释至2mol／L，封管后于95℃水浴锅中水解18h，获得β-（1，3）-D-葡聚糖的水解液.按照苯酚－硫酸法于490nm下测定吸光度.

2 实验结果

2.1 影响RNA提取的因素

2.1.1 RNA标准曲线

本研究采用地衣酚-Cu2＋法测定了RNA的含量，共获得6组吸光度值，结果见表2；制定的RNA标准曲线见图1.

表2 RNA标准品的吸光度

2.1.2 酵母中RNA的含量

RNA提取样品吸光度为0.320，带入经计算得出RNA的纯度为70.24%.

2.1.3 温度对RNA提取的影响

如表3所示，温度在80℃～100℃时，随着温度的升高，RNA产率不断上升，在100℃时达到最高.因为温度高于100℃时，RNA容易分解，影响产率.综合考虑可控性、产率等众多因素影响，选择的温度为100℃.

图1 RNA标准曲线

表3 抽提温度对RNA提取产量的影响g

2.1.4 NaOH质量分数对RNA提取的影响

如表4所示，碱提加入的NaOH质量分数为4%时产量最高，随着浓度的增加产量明显下降，可能是由于浓度高破壁效果不好以及核酸变性所致.因此提取时NaOH质量分数选择为4%.

表4 NaOH质量分数对RNA提取产量的影响 g

在100℃，NaOH质量分数为4%的条件下进行综合提取，得到的RNA产物干燥后呈乳白色略微带有些黄色，干燥直到恒重后经称量得到RNA 0.765g，提取率为7.65%.

2.2 β-（1，3）-D-葡聚糖含量的测定

2.2.1 葡萄糖的标准曲线

由标准糖溶液测得的各浓度梯度的吸光度值见表5，制作的标准曲线见图2.

表5 标准糖溶液的吸光度值

2.2.2 β-（1，3）-D-葡聚糖含量

经中性蛋白酶作用后得β-（1，3）-D-葡聚糖0.684g，经碱性蛋白酶作用后得β-（1，3）-D-葡聚糖0.560g.测得样品吸光度分别为0.282，0.266，带入计算得中性蛋白酶和碱性蛋白酶处理得到的产物纯度分别为76.6%和61.6%.

3 讨论

本实验为实现工业化的RNA提取提供了依据.当然，尽管本实验给出了优化分析方法，但要想使β-（1，3）-D－葡聚糖的研究、生产和实际应用等能够产业化，其含量分析须有国际统一标准.本实验所设计的提取流程仅局限于RNA和β-（1，3）-D-葡聚糖的提取利用，而啤酒酵母中仍然含有大量的其他营养物质，如取超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱苷肽（GSH）、果糖二磷酸钠（FDP）、B族维生素和酶等.如何能够最大限度地在同一平台上进行多种营养物质的综合提取，实现营养物质经济价值的最大化是今后研究的方向.

图2 苯酚－硫酸法糖溶液的标准曲线

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Synthetic extraction of RNA andβ-（1，3）-D-Glucan from waste beer yeast

WANG Zhi-hong1，XING Shen-yang2，ZHANG Gui-rong3

（1.Basic Medical College，Changchun University of Chinese Medicine，Changchun 130117，China；
2.Animal Husbandry Veterinary College，Jilin University，Changchun 130062，China；
3.Life Science College，Jilin University，Changchun 130012，China）

The present paper studies the influence of temperature and NaOH concentration on the synthetic extraction of RNA andβ-（1，3）-D-Glucan from waste beer yeast.The experiment uses the alkali-enzyme extraction method and optimizes the dilute alkali extraction conditions to bring about the synthetic extraction.The experiment shows that the extraction rate is 7.65%and the degree of purity is 70.24%with a temperature of 100°C and the concentration of NaOH for 4%.Furthermore，the experiment investigates the influence of neutral protease and alkaline protease on the extraction of β-（1，3）-D-Glucan and finds that neutral protease may facilitate moreβ-（1，3）-D-Glucan of higher purity.It is believed that the experiment results lay a foundation for industrial production.

waste beer yeast；RNA；β-（1，3）-D-Glucan；alkali-enzyme extraction method

R 963

310·4730

A

1000-1832（2012）02-0095-04

2011-12-13

国家自然科学基金资助项目（30870251，31070309）；教育部985平台项目.

王志宏（1965-），男，副教授，主要从事中医药及生化药物研究；通讯作者：张桂荣（1964-），女，博士，教授，主要从事分子生物学及生物化学研究.

方 林）