正交实验选择纤维素酶产生菌的最优综合培养条件

黄蓉姿,万金泉,马邕文,黄明智,3,杨漪清 (.华南理工大学环境科学与工程学院,广东 广州 50006；2.华南理工大学工业聚集区污染控制与生态修复教育部重点实验室,广东 广州 50006；3.华南理工大学化学与化工学院,广东 广州 5064)

正交实验选择纤维素酶产生菌的最优综合培养条件

黄蓉姿1,2,万金泉1*,马邕文1,黄明智1,3,杨漪清1(1.华南理工大学环境科学与工程学院,广东 广州 510006；2.华南理工大学工业聚集区污染控制与生态修复教育部重点实验室,广东 广州 510006；3.华南理工大学化学与化工学院,广东 广州 510641)

在复合碳源、30℃恒温培养条件下,用正交实验法对影响纤维素酶产生菌降解纤维素的 5种单因素培养条件进行了优化,并将优化得到的条件应用于厌氧-好氧废水处理系统.结果表明,MgSO4用量等单因素对纤维素酶活性以及纤维素降解率有不同程度的促进作用;正交实验得到厌氧菌和好氧菌的最佳培养条件不完全一致;在废水处理系统中,5种单因素的最佳综合水平为:30mg/L MgSO4,20mg/L CoCl2,CNP配比为400:5:1,氮源为NH4Cl (28.7mg/L), pH=7.0,此时厌氧菌及好氧菌酶活性分别为4801U/L和4794U/L,酶稳定性分别达到91.0%和95.5%,纤维素降解率为31.9%和28.4% .

正交实验；酶活性；酶稳定性；纤维素降解率

造纸行业会产生大量含纤维素的废水,机械过滤只能去除其中不溶解的、粒径较大的杂质,仍有一些细小纤维进入后续的生物处理过程中[1].生物处理可以有效降低纤维素废水的污染物负荷,提高废水的可生化性[2].纤维素的生物降解依赖于纤维素酶产生菌的生理过程,受系统环境因素影响很大[3],因此寻找最佳的产酶条件成了众多学者关注的问题.但目前纤维素酶在环境领域的研究主要集中在降解固体废物中的纤维素方面[4-5],很少见到纤维素酶在废水处理系统中的报道.

为了强化造纸废水细小纤维的生物降解过程,缩短废水处理周期,本研究在以前选定的碳源和温度条件[6]下,考察另外 5种单因素综合培养条件下对纤维素酶产生菌的调控作用,包括MgSO4用量、CoCl2用量、CNP配比、氮源组成以及pH值等.由于影响因素较多,通过设计正交实验 L16(45),在一定程度上避免了选择最佳培养条件的盲目性.

1 材料与方法

1.1 材料

本实验采用的厌氧菌和好氧菌为复合菌,取自实验室生物挂膜的厌氧-好氧折流式工艺反应器装置.接种污泥取自广州市猎德污水处理厂的二沉池,驯化期间采用葡萄糖和纤维素废水混合作为基质[7].

基础培养溶液为:葡萄糖(第 1碳源): 600mg/L,少量 NaHCO3、CaCl2、MnSO4、Fe2(SO4)3、ZnCl2等无机盐.以上述溶液为基础,依据正交实验分配分别加入不同组分或改变某些组分的用量(表1),配成不同正交组液体培养基.

表1 各因素的水平列表Table 1 List of factors’ levels

微晶纤维素(MCC),购于国药集团化学试剂有限公司,粉碎过200目筛.

1.2 实验方法

1.2.1 培养方法 采用2个为一组的200mL摇瓶模拟厌氧-好氧反应器,每隔12h更新各摇瓶中的培养液,厌氧瓶的用基础培养基进行更新,好氧瓶的用停留厌氧瓶12h后的培养基进行更新.各摇瓶装40mL培养液、100mg微晶纤维素(第2碳源),将20mL厌氧或好氧菌悬液接种于对应的培养基,然后置于30℃振荡培养箱(厌氧108r/min,好氧180r/min)中培养5d ,测定厌氧菌、好氧菌的纤维素酶活性以及纤维素降解率.依照 5因素 4水平正交实验的设计(表2),共有16组厌氧-好氧实验,均做平行实验.

将正交实验优化得到的培养条件应用于厌氧-好氧折流式反应器,培养5d,取出生物膜,制成菌悬液,测定系统中厌氧菌、好氧菌的纤维素酶活性、酶稳定性以及纤维素降解率.

1.2.2 酶活性测定 纤维素的最终酶解产物是葡萄糖,通过测定底物酶解后的葡萄糖生成量来表征纤维素酶活性,本实验采用离子色谱法测定葡萄糖含量.具体方法为:培养结束后,从各摇瓶中取出上清液,并用 0.22μm的水相滤膜过滤,测定葡萄糖浓度,作为实验的空白值 C0;另取新的试管,加入5mL培养后的菌悬液、10mg微晶纤维素、5mL柠檬酸缓冲液,在50℃水浴中保温1h,反应后取出溶液,并用 0.22μm的水相滤膜过滤,测定葡萄糖浓度C.

离子色谱条件:离子色谱仪:DIONEX ICS –3000;分析柱:CarboPac PA1(2@250mm);保护柱: CarboPac PA1 (2@50mm);淋 洗 液 : 0.001molNaOH-0.05molNaAC;体 积 流 量 : 0.500mL/min;进样体积:10μL;柱温:30e;检测器:脉冲安培检测器,金电极.

1.2.3 纤维素酶活性的定义及计算 纤维素酶活性定义:以底物在50℃,pH4.8,恒温一定时间的条件下,以水解反应中每克悬浮固体每小时催化底物水解形成 1.0mg葡萄糖的酶量定义为一个活力单位,用U表示.酶活的计算公式为:x = (C –C0)/(MLSS⋅T),式中:x为纤维素酶活性, U;C为样品的葡萄糖浓度,C0为空白实验的葡萄糖浓度,mg/mL;MLSS为混合液悬浮固体浓度,g/mL;T为反应时间,h.

1.2.4 酶稳定性测定 取完成培养的生物膜样品,制成菌悬液,用甲苯进行灭菌,室温保存 4h,测定纤维素酶的残余酶活性,以 0h酶活性为标准(100%)计算相对酶活性.

1.2.5 纤维素降解率测定 参照文献[8],培养结束后,倒掉上清液,用蒸馏水轻轻洗去菌体,将固形物置于60℃烘箱中烘至恒重,用电子天平分别称量未被降解的微晶纤维素质量,记为 Wi(g),培养前的微晶纤维素质量记为 W0(g),则降解率η=(W0-W1) /W0×100%.

2 结果与讨论

2.1 5因素4水平正交实验分配与结果

由表 2可见,无论是厌氧段还是好氧段, MgSO4用量、CoCl2用量、CNP配比、氮源组成、pH值5种因素在单因素条件下对纤维素酶产生菌的产酶和降解能力均有一定的促进作用.

表2 5因素4水平正交实验分配及结果Table 2 Disposition and result of orthogonal experimental design L16(45)

2.1.1 厌氧菌产酶及降解能力 由表 3、表 4可见,厌氧菌产酶及降解效果最佳的实验条件组合完全一致,均为 A4B4C4D3E2,即:厌氧菌在30mg/L MgSO4、30mg/L CoCl2、CNP比为400:5:1、CO(NH2)2:NH4Cl=1:2的混合氮源、pH6.0时,纤维素酶活性最高,纤维素降解率最大.

根据极差分析各因素对酶活性变化影响大小的顺序为MgSO4＞氮源组成＞CoCl2＞CNP配比＞pH值,而对降解率变化的影响顺序为MgSO4＞ 氮源组成 ＞ CNP配比 ＞ CoCl2＞ pH值,可见5种因素中,影响厌氧段纤维素酶产生菌生长代谢的主要因素是MgSO4和氮源组成,而pH值对酶活性和降解率影响较小,可能是产纤维素酶的厌氧微生物在这4种pH值条件下生长状况相似的缘故.何品晶等[9]通过研究pH值对有机垃圾厌氧水解的影响,发现发酵液的pH值为5～7时有利于颗粒态有机物的水解.

表3 厌氧菌酶活性(U/L)Table 3 Enzyme activity of anaerobe (U/L)

表4 厌氧段纤维素降解率(%)Table 4 Degradation-rate of cellulose in anaerobic stage(%)

2.1.2 好养菌产酶及降解能力 由表 5、表 6可见,好氧菌产酶效果最佳的实验条件组合为A4B3C4D2E3,而 降 解 效果 最 佳 的 组 合 为A4B3C4D3E3,两者非常接近,仅在氮源组成上有差别,分别为CO(NH2)2: NH4Cl＝0∶3和CO(NH2)2: NH4Cl＝1∶2,其他条件组合为30mg/L MgSO4、20mg/L CoCl2、CNP比为400:5:1、pH=7.0.

各因素对酶活性变化影响的顺序为CNP配比 ＞ pH 值＞ CoCl2＞ MgSO4＞ 氮源组成,而对降解率变化的影响顺序为CNP配比 ＞ pH 值＞MgSO4＞ CoCl2＞ 氮源组成,可见在5种因素中,影响好氧段纤维素酶产生菌生长代谢的主要因素是CNP配比和pH值.而氮源组成对实验结果影响不大;同时经F检验,氮源组成对酶活性和降解率的影响也不显著.

表5 好氧菌酶活性(U/L)Table 5 Enzyme activity of aerobe (U/L)

表6 好氧段纤维素降解率(%)Table 6 Degradation-rate of cellulose in aerobic stage(%)

2.1.3 正交实验各因素的影响 由图 1、图 2可见,无论是厌氧菌还是好氧菌,它们各自的因素-指标趋势基本吻合,即同一因素水平条件下的酶活性与降解率呈现出较好的对应关系,这也说明纤维素类物质的降解主要依靠微生物分泌的纤维素酶进行[10].

金属离子是微生物生长必不可少的一类营养物质[11],而且厌氧过程中缺乏微量金属营养元素产生的不利影响比好氧过程要大[12].对比图 1与图 2,Mg2+的作用趋势几乎相同,都在30mg/L时达到最佳效果;但厌氧菌和好氧菌对于 Co2+的浓度要求存在较大差异,主要是20,30mg/L,说明不同微生物对 Co2+的浓度要求不同.李德莹等[13]研究金属离子对纤维素酶活力的影响发现,Mg2+、Co2+离子浓度在一定范围内,对纤维素酶活性有激活作用,Mg2+、Co2+分别在1.2、0.2mg/mL时,酶活性达到峰值,浓度增大表现出抑制作用.相比之下,本研究金属离子作用浓度较低.

图1 厌氧段各因素的作用趋势Fig.1 Effect of different factors in anaerobic stage

图2 好氧段各因素的作用趋势Fig.2 Effect of different factors in aerobic stage

厌氧菌和好氧菌均在400:5:1的CNP配比下生长良好,酶活性和降解率达到较高水平.这个比例与经验值(厌氧条件下 200:5:1及好氧条件下100:5:1)略有出入,说明微生物对碳源的需求和竞争增大,可能跟系统中的微生物种类有关系,有待进一步的研究.

由图1、图2可以看出,氮源组成对厌氧菌影响显著,对好氧菌影响甚小.但对于氮源组成的要求,两者都偏向无机氮源比例较大的混合氮源,即CO(NH2)2: NH4Cl＝1∶2.相对来说,无机氮源比有机氮源更好,因为有机氮源同时作为碳源,有可能优先于纤维素被利用,一定程度上妨碍了纤维素的降解[14].殷中伟等[15]、徐昶等[16]通过研究不同氮源对纤维素降解菌产酶的影响发现,以硝酸盐为无机氮源时酶活力最高.

本实验得出pH6.0、pH7.0分别适合厌氧菌、好氧菌的生长,在中性偏酸及中性的条件下表现出较高的酶活性和降解能力.pH值通过影响微生物群落结构的变化影响有机物的代谢过程.叶凝芳等[17]通过Shannon指数分析表明,pH 7或8时的微生物多样性较高.一般情况下,生物多样性越高,其代谢关系越复杂,结构越稳定,对污染物的协同作用能力也越大[10].何品晶等[9]认为,在pH值为5、6、7、8条件下,微生物处于静止生长期时,水解速率常数处于同一个数量级,且发酵液pH7时最有利于微生物的合成代谢.

2.2 纤维素降解菌的最优综合培养条件

由于以上的摇瓶模拟实验得出厌氧菌产酶及降解效果最佳、好氧菌产酶效果最佳、好氧菌降解效果最佳的3种条件组合(表7),彼此间略有差异,为进一步得到废水处理系统中纤维素酶产生菌的最优综合培养条件,将优化得到的3种组合分别应用于厌氧-好氧折流式反应器,考察系统中厌氧菌、好氧菌的纤维素酶活性、酶稳定性以及纤维素降解率.

由表8可见,实验2的培养条件比较理想,因为厌氧菌和好氧菌产酶比较均衡,且酶稳定性较高,对纤维素的降解效果明显.实验2和实验3的培养条件仅在氮源组成上有差别,而实验2得到的厌氧菌和好氧菌酶活性都高于实验 3,分别提高到1.12倍和1.72倍,纤维素降解率分别提高了2.5%和 11.7%,说明无机氮更容易被微生物吸收利用,废水生化处理系统中适当浓度的氨氮对厌氧微生物的生长有刺激作用[18].实验1的酶稳定性较低,可能是Co2+的浓度偏高,不利于底物与酶活性中心的结合,导致酶活性随时间变化呈下降趋势.

表7 正交实验优化得到的培养条件Table 7 Culture conditions optimized by orthogonal experiments

表8 三种培养条件下的实验结果Table 8 Results under three kinds of culture conditions

本研究得到的纤维素降解率不到 40%,理论上还有一定的提升空间.纤维素的降解需要多种酶的协同作用,今后可以考虑在废水生化处理系统中加入人工筛选的优势菌,构建产多种纤维素酶的高效稳定复合菌系[19],提高纤维素的处理率.

3 结论

3.1 厌氧菌产酶及降解效果最佳的实验条件组合一致,均为30mg/L MgSO4、30mg/L CoCl2、CNP比为400:5:1、CO(NH2)2:NH4Cl=1:2的混合氮源、pH6.0.

3.2 好氧菌产酶效果最佳的实验条件组合为30mg/L MgSO4、20mg/L CoCl2、CNP比为400:5:1、氮源为NH4Cl,pH7.0,而降解效果最佳的组合为30mg/L MgSO4、20mg/L CoCl2、CNP比为400:5:1、CO(NH2)2: NH4Cl=1:2的混合氮源、pH7.0.

3.3 在厌氧-好氧废水处理系统中,当培养条件为 30mg/L MgSO4、20mg/L CoCl2、CNP比为400:5:1、氮源为NH4Cl (28.7mg/L)、pH7时,微生物的产酶和降解效果最佳,厌氧菌及好氧菌酶活性分别为4801 U/L、4794U/L,酶稳定性分别达到 91.0%、95.5%,纤维素降解率为 31.9%和28.4%.

[1] 苗庆显,秦梦华,徐清华.废纸造纸废水处理技术的现状与发展[J]. 中国造纸, 2005,24(12):55-58.

[2] 曾 科,高健磊,陈四州,等.含纤维素废水生物水解的应用研究[J]. 重庆环境科学, 2003,25(5):36-38.

[3] 梁越敢,郑 正,汪龙眠,等.干发酵对稻草结构及产沼气的影响[J]. 中国环境科学, 2011,31(3):417-422.

[4] 罗宇煊,张甲耀,龚利萍,等.正交实验选择嗜碱细菌降解木质素的最优综合培养条件 [J]. 环境科学, 2001,22(5):95-98.

[5] 叶劲松,吴 克,蔡敬民,等.生物垃圾好氧处理中的纤维素降解菌生长规律研究 [J]. 生物技术, 2007,17(2):69-72.

[6] 黄蓉姿,万金泉,马邕文,等.废水处理系统中纤维素酶的诱导形成及调节控制 [J]. 造纸科学与技术, 2011,30(2):52-55.

[7] 潘碌亭,吴锦峰,罗华飞.微电解-UASB-接触氧化处理羧甲基纤维素废水 [J]. 化工学报, 2010,61(5):1275-1281.

[8] 张 楠,刘东阳,杨兴明,等.分解纤维素的高温真菌筛选及其对烟杆的降解效果 [J]. 环境科学学报, 2010,30(3):549-555.

[9] 何品晶,潘修疆,吕 凡,等. pH值对有机垃圾厌氧水解和酸化速率的影响 [J]. 中国环境科学, 2006,26(1):57-61.

[10] 彭绪亚,丁文川,吴正松,等.垃圾渗出液微生物循环强化培养菌剂在堆肥中的作用 [J]. 环境科学学报, 2005,25(7):959-964.

[11] 董义伟.绿色木霉固态发酵降解纤维素的研究 [D]. 成都:四川大学, 2006.

[12] 董春娟,吕炳南,苏秀英.废水厌氧处理系统微量金属生物有效度及影响因素 [J]. 化工环保, 2004,24(3):190-193.

[13] 李德莹,龚大春,田毅红,等.金属离子对纤维素酶活力影响的研究 [J]. 酿酒科技, 2009,(6):40-42.

[14] 何良菊,李培杰,魏德洲,等.石油烃微生物降解的营养平衡及降解机理 [J]. 环境科学, 2004,25(1):91-94.

[15] 殷中伟,范丙全,任 萍.纤维素降解真菌Y5的筛选及其对小麦秸秆降解效果 [J]. 环境科学, 2011,32(1):247-252.

[16] 徐 昶,龙敏南,邬小兵,等.高产纤维素酶菌株的筛选及产酶条件研究 [J]. 厦门大学学报, 2005,44(1):107-111.

[17] 叶凝芳,何品晶,吕 凡,等.厌氧发酵过程pH对微生物多样性和产物分布的影响 [J]. 应用与环境生物学报, 2007,13(2):238-242.

[18] 杨 剑.规模化养猪场废水氨氮对厌氧微生物活性的影响及生物脱氮的研究 [D]. 南宁:广西大学, 2005.

[19] 牛俊玲,崔宗均,李国学,等.高效纤维素分解菌复合系的筛选构建及其对秸秆的分解特性 [J]. 农业环境科学学报, 2005,24(4): 795-799.

Optimization of synthetic culture condition of cellulase producing strains using orthogonal experimental design.

HUANG Rong-zi1,2, WAN Jin-quan1*, MA Yong-wen1, HUANG Ming-zhi1,3, YANG Yi-qing1(1.College of Environmental Science and Engineering, South China University of Technology, Guangzhou 510006, China；2.Key Laboratory of Pollution Control and Ecosystem Restoration in Industry Clusters, Ministry of Education, South China University of Technology, Guangzhou 510006, China；3.School of Chemistry and Chemical Engineering, South China University of Technology, Guangzhou 510641,China). China Environmental Science, 2012,32(1)：130～135

The five single factors for cellulose biodegradation ability of cellulase producing strains were optimized by orthogonal experiments using mixed carbon source under 30°C, and were used in wastewater treatment system with anaerobic and aerobic processes. Five single culture factors promoted cellulase activity and cellulose degradation-rate in varying degrees. Moreover, the optimal culture conditions of anaerobe obtained through orthogonal experiments were not in accordance with that of aerobe. In the wastewater treatment system, the optimal synthetic condition was MgSO4of 30mg/L, CoCl2of 20mg/L , the ratio of CNP of 400:5:1, NH4Cl (of 28.7mg/L) as nitrogen source and pH7.0 . The cellulase activities (CA), enzymatic stabilities (ES), and cellulose degradation-rates (CDR) of anaerobe and aerobe were as follows: CA: 4801U/L, 4794U/L; ES: 91.0%, 95.5%; CDR: 31.9%, 28.4% .

orthogonal experiment；enzyme activity；enzymatic stability；cellulose degradation rate

2011-04-25

广东省首批“节能减排”重大专项“造纸废水循环利用新技术集成与示范”(2008A080800003);广东省自然科学基金(S2011040000389);中央高校基本科研业务费专项资金资助(2011ZM0049)

* 责任作者, 教授, ppjqwan@scut.edu.cn

X172

A

1000-6923(2012)01-0130-06

黄蓉姿(1986-),女,广东汕头人,华南理工大学硕士研究生,主要从事工业废水生物处理的研究.发表论文1篇.